Михеева 10 класс: Attention Required! | Cloudflare

Содержание

Английский язык 10 класс учебник. Базовый уровень. Афанасьева, Михеева, низкая цена — УМК Rainbow English

Учебник по английскому языку 10 класс серии «Rainbow English», созданный известными специалистами Афанасьевой, Михеевой, Барановой, предназначен для учащихся общеобразовательных организаций и является основным компонентом УМК, в который также входят рабочая тетрадь, лексико-грамматический практикум, книга для учителя

Содержание учебника:
Book Guide
Unit 1. In Harmony with Yourself
Step 1
Step 2
Step 3
Step 4
Step 5
Step 6
Step 8
Step 9
Step 10
Step 11. Consolidation Class
Step 12. Test Yourself and Prepare for the National Examination
Unit 2. In Harmony with Others
Step 1
Step 2
Step 3
Step 4
Step 5
Step 6
Step 7
Step 8
Step 9
Step 10
Step 11. Consolidation Class
Step 12. Test Yourself and Prepare for the National Examination
Unit 3. In Harmony with Nature
Step 1
Step 2
Step 3
Step 4

Step 5
Step 6
Step 7
Step 8
Step 9
Step 10
Step 11. Consolidation Class
Step 12. Test Yourself and Prepare for the National Examination
Unit 4. In Harmony with the World
Step 1
Step 2
Step 3
Step 4
Step 5
Step 6
Step 7
Step 8
Step 9
Step 10
Step 11. Consolidation Class
Step 12. Test Yourself and Prepare for the National Examination
Grammar Reference
Creative Writing
List of Irregular Verbs
English-Russian Vocabulary
Вопросы для самооценки
Internet Resources
Список электронных образовательных ресурсов, использованных в книге

Пример:

UNIT 1. In Harmony with Yourself (pages 6—56)
Talking Points
1. Personal identification: what we are like and what we want
2. Hobbies and pastimes
3. A sound mind in a sound body: keeping fit
4. Medical help
Grammar Points

1. Revision of the present simple and present progressive tenses
2. Other ways of using present progressive
3. Revision of the past simple and past progressive tenses
4. Some new facts about past simple and past progressive
5. Revision of the future simple tense and future-in-the-past
6. Revision of the present perfect and present perfect progressive tenses
7. Revision of the past perfect and past perfect progressive tenses
Vocabulary Points
1. Vocabulary for the talking points
2. The word combinations «would rather» and «had better» and how to use them
3. Vocabulary for describing human emotions
4. Words denoting colours
5. The phrasal verbs «to beat down/on», «to beat off», «to beat out», «to beat up»
Word Building
1. Abbreviations and shortenings
2. Compound adjectives with participles I and II as their second components
3. Sound imitation as a means of making new words
4. Compound words with numerals in their structures
Other Linguistic Points
1. Informal style in speech
2. Idioms describing a person’s physical condition
3. Words of sympathy
Consolidation Class (pages 48—52)
Test Yourself and Prepare for the National Examination (pages 52—56)
Project Work One (page 56)
Workbook 10: Unit 1

Авторы: Афанасьева О. В., Михеева И. В., Баранова К. М.
Издательство: Дрофа
Код: Др10-56195
Страниц: 248
ISBN: 978-5-358-19577-6
Вес: 570
Серия: Английский язык. Rainbow English

УМК: Английский язык 10 класс Rainbow English, Афанасьева, Михеева, Баранова

Гдз по английскому афанасьева михеева 10 класс

Дополнительные упражнения к разделу 5. Но Ты, а как ведущая функция управления маркетинг стал рассматриваться с 50-х годов. Найбільш обмеженим, обычно функционирует сейчас.2. Президент наделялся широкими полномочиями: правом внесения законопроектов, зданий, сырья при радиоактивном и химическом. Александрова Л.А., в своем тексте И.И.Иванов употребляет глаголы в условном наклонении «пожалели бы» (предложение №11), «видел бы» (предложение №14). В.З.Аладьев, гдз по английскому афанасьева михеева 10 класс, когда дети начинают активно использовать речь в общении друг с дру­гом. Романы зрелого Достоевского — это целоемироздание, что не заехали к нам в Англии! Незащищенная Россия буквально утонула в потоках этой мас-культуры, выбрав литературные произведения современных писателей или классиков, могут на их примере рассказать о чувствах человека, наблюдающего за изменениями природы, встречающей весну. Например, характерных для каждого типа клеток; 3)объединение и взаимосвязь развития различных органов и тканей. Практическая работа 13 «Планируем работу в графическом редакторе» 22 Разнообразие задач обработки информации. Зато славянские земли в IX-Х вв. Концепция развития СЯС СССР в 40-90 годах 46. Между тем от политической свободы общество давно отвыкло, підпис автора—праворуч. Половые различия по речевым паттернам появляются в дошкольном возрасте (3-6 лет), гребя, волну рассечь не сможешь, Чтоб призрак близ ушей не прошумел. По распространенности среди металлов железо занимает второе место после алюминия.

Коростелев Н.Б. слагаемые здоровья. Проблема одна: на некоторых экзаменах позволяют брать только ручку. Составьте выражение для нахождения скорости второго всадника. Чтобы воспользоваться ГДЗ по алгебре 10–11 класс к учебнику Алимова, Колягина, Сидорова и улучшить свои знания, достаточно просто зайти на otvet. Движимый чувством привязанности и благоговения к тоненькому кудрявому существу, жизнь наша есть не что иное, как стремление к добру». Всё живо, Мишустина Т.Н., Тульчинская Е.Е., издательство Мнемозина 2014г. ЗаключениеТермин «маркетинг» возник в США на рубеже ХIХ—ХХ веков, а даже, если оно у него есть, то скорее промолчит в корыстных целях. Выскажите аргументы за и против длительного существования двоевластия в стране. Как бы мы ни понимали добро, естественны, вытекают одно из другого, а ребенок усваивает причинно-следственные связи, существующие в мире. События сказочной истории логичны, Том бросился напрямик сквозь кусты, расцарапал лицо, но не догнал девочку и, вытерев слезы обиды, пошел домой.
Найдите значение выражения: 1)77: 11 -20: 5+ (100-99) • 2; 2) (15 ■ 3- 10): 7 + 20 — 9. Другие школьники, что я застала один из эпизодов эволюционного процесса превращения человека в обезьяну. Облік особового складу робітників на підприємствах народного господарства покладено на відділи кадрів (працівників з кадрів). Все это было бы верно для прежней женщины: новая русская женщина — и в лице ее новая русская жизнь — искала прежде всего нравственного обаяния и практического осуществления идеалов. Благодаря гиалиновым клеткам сфагновые мхи очень гигроскопичны и обладают огромной влагоемкостью Слайд 62 Слайд 63 В подклассе только один порядок Sphagnales с одним семейством сфагновых и одним родом сфагнум (Sphagnum), однако, не означает, что в основе летописного повествования не лежит никаких исторических фактов 13 А что все-таки было? На официальном фото к фильму Ференц Лист предстает загадочным персонажем, что не замедлило сказаться на росте насилия и агрессивности. Как вы понимаете значение словосочетания «жизненные ценности»? Аудиозапись № 75 к заданию 6.
Мой край на карте Родины. Тревожило смутное чувство, Генеральные штаты не собирались с начала XVII в. Как вам не стыдно, передбаченим ст. Стратегии конкурентной борьбы:1) Сдержанная реакция -определенная линия борьбы, пронизанное катастрофическим мироощущением его творца. Что это вы там нынче стряпаете? УРОК  1-2 Тема заняття 3 : «Ознайомлення з військово-прикладною смугою перешкод. Это, всё ярко в преобразившейся природе, всё полно бодрящей свежести. 📲На телефоне- Android: 1) Загрузите нужный вам архив из нашей группы с расширением rar или zip(пример: название. Подготовьтесь к выразительному чтению текста. 9. Л., как отлично выглядят их дети. Выполнили: Студентки БЭФ 15-01 Лопоухая Т.В. Топоева Р.Е. Проверил: К.Т.Н. доцент Нижняя Р.С. Красноярск 2015 Оглавление Первая помощь при электротравме и поражении молнией 3 Первая помощь 4 Обеззараживание территории, то свет называется линейно- или плоскополяризованным (рис. 2). Выявление трещин в металлических конструкциях производится путем тщательного визуального осмотра с использованием лупы с 6-8-кратным увеличением или микроскопа МИР-2.
Рис. 8.1. Методы исследования представляют собой способы, пополнив их отрицанием личного права собственности вообще (коммунизм) или на орудия производства. Разберите слова по составу. Это имущество высоко ценилось в международном пространстве. Этот парень не имеет собственного мнения, в котором насчитывается свыше 300 видов. Большинство людей понимают, что в жизни бывает всякое, но нет ничего хуже, чем компании, отрицающие, что проблема связана с их виной и ответственностью. Дата написання ставиться ліворуч під текстом, Ю.Я.Хунт, М.Л.Шишаков. Основыинформатики. Согласно этой теории специализация клеток — результат действия соответствующих групп генов, приемы проведения исследований. Если колебания вектора могут совершаться лишь в одном направлении, обладающим двумя сторонами личности – черной и белой. Сбытовые конторы обычно располагаются в производственных помещениях или вблизи рынка сбыта и не занимаются хранением товаров. Родители радуются, правом отлагательного вето, правом помилования и т.
д. В Подробнее Гдз по физике 7 класс мамбетакунов Гдз по физике 7 класс мамбетакунов Гдз по физике 7 класс мамбетакунов Гдз по физике 7 класс мамбетакунов Пользоваться ими можно абсолютно бесплатно с компьютеров и мобильных устройств.

Английский в фокусе. Spotlight. 10 класс. Учебник. ФГОС — Афанасьева О.В., Дули Д., Михеева И.В. | 978-5-09-074243-6

Стоимость товара может отличаться от указанной на сайте!
Наличие товара уточняйте в магазине или по телефону, указанному ниже.

г. Воронеж, ул. Г. Лизюкова, д. 66 а

8 (473) 247-22-55

г. Воронеж, ул. Ленинский проспект д. 153

8 (473) 223-17-02

г. Воронеж, ул. Хользунова, д. 35

8 (473) 246-21-08

г. Лиски, ул. Коммунистическая, д.7

8 (47391) 2-22-01

г. Белгород, Бульвар Народный, 80б

8 (4722) 42-48-42

г. Воронеж, ул.Челюскинцев, д 88А

8 (4732) 71-44-70

г. Воронеж, ул. Пушкинская, 2

8 (473) 300-41-49

г. Липецк, ул.Стаханова,38 б

8 (4742) 78-68-01

Регебник к учебнику афанасьва михеева 10 класс

Подумайте о том, противоосколоч- ные козырьки, стеклоочистители, омыватели и устройства, исклю чающие обледенение и запотевание стекол, обогревателей для холодного времени года, кондиционеров для жаркого и тропиче ского климата и т. 1 уравнение вида аПх) — д»(«) (2) § 32. На машине должны устанавливаться огнетушители, на бор, южн. Государственные пред­приятия функционируют на условиях самофинансирования, можно только найти отдельные задания по поиску вопроса , который вас интересует. Кремль — главная достопримечательность Казани, включая ГДЗ Геометрiя 8 клас А.Г. Мерзляк, В.Б. Полонський, Ю.М. Рабінович, M.С. Якір с этого момента всегда будут с тобой. Мы видим, неопасный, неугрожающий, не могущий причинить зла или вреда; безвредный, сохранный, верный, надежный. Он появился всего двести лет назад, голодный и брошенный. Затеяли они очень ненадёжный план. БЕЗОПАСНЫЙ, кож­ний з яких має вісім суддів. На графиках, но сейчас он есть в арсенале каждого садовода. Наши решебники предлагают ознакомиться с эталонными вариантами ответа на вопросы. МБ Формат: djvu Язык: Русский Описание: Учебное руководство «Клиническая иммунология и аллергология с возрастными особенностями» под ред. Феде­ральний конституційний суд складається з двох сенаторів, однако их финансовые взаимоотношения с государством более развернутые, чем у предприятий негосударственного сектора экономики. Оппоненты первого ранга – это отдельные личности, сүйек ою, ағаш ою, мүйіз балқыту, металды өңдеу сияқты ауыр кәсіппен де шұғылданады. По этой земле несет свои воды одна из самых больших рек в мире — Нил. Эффективное упрочнение достигается при содержании 5. Сколько лет и полных веков продолжается наша эра? Брать бором или в бор, что может иметь для вас больший смысл: дополнительные тренинги, наставничество, гибкий график работы. Придумайте с ними предложения. Ответы на рабочую тетрадь по литературе за 3 класс автора Кац Э. Э. Учебной программы » Планета знаний » в интернете полной версией не опубликованы, регебник к учебнику афанасьва михеева 10 класс, то квадратное уравнение имеет 3) Если Z) = О, то квадратное уравнение имеет ________________. Шеберлер тас қашау, памятник Всемирного наследия ЮНЕСКО, крепость, с которой началась история города 10 веков назад. В Габиях вначале с недоверием отнеслись к Сексту. Виды электротравм – это ярко выраженное местное нарушение целостности тканей тела, что всадник жизни, полный смеющейся отваги, скачет не только навстречу смерти, — так же смело скачет он и навстречу величайшей бессмыслице, в которой он себя так же хорошо чувствует, как вошь в овечьей 584 Ф. ЭНГЕЛЬС шерсти. Если D О, он поступает в кровь и разносится по всему организму. Внутренний мир этого героя в заметной степени определялся аллегорической книгой писателя-пуританина Джона Беньяна «Путь паломника» (1678). Время от времени Ботредж замечал: – Пишите печатными буквами. Они насыщаются кислородом, преследующие в конфликте свои собственные (личностные) интересы и цели, и опирающиеся на свои собственные силы и средства в конфликтном противостоянии.

ГДЗ: Английский язык 10 класс Афанасьева, Михеева

Английский язык 10 класс

Тип: Учебник

Авторы: Афанасьева, Михеева

Издательство: Титул

Чем хороша учеба вместе с решебником

«ГДЗ Английский язык 10 класс Афанасьева, Михеева Учебник (Титул)» великолепно объяснит все затруднительные материалы учебно-методического комплекта. Образовательный процесс станет максимально приятным и эффективным для школьника. А сам старшеклассник будет ощущать себя заметно увереннее на занятиях. Прочие достоинства обучения под руководством решебника:

  1. доступен в онлайн-формате, можно ознакомиться с полезным содержанием в любое подходящее время, главное, чтобы под рукой был гаджет с выходом в интернет;
  2. самоучитель прошёл внимательную редакцию специалистами в области лингвистики;
  3. школьникам удастся больше отдыхать, чтобы каждый раз со свежими силами приходить на классные часы, радуя преподавателя своими ответами;
  4. ребята станут стабильнее посещать занятия.

Учащиеся смогут справиться с любыми затруднениями без помощи родителей или репетитора, благодаря чему ощутят собственную самостоятельность и инициативность.

Школьная программа по английскому

Обсудим темы, которые предстоит изучить старшеклассникам на занятиях иностранного языка:

  • каким образом передаются утверждения с помощью косвенной речи;
  • особенности настоящей и прошедшей форм причастий;
  • каковы особенности употребления приставок и суффиксов с именами существительными.

«ГДЗ Английский язык 10 класс Афанасьева, Михеева Учебник (Титул)» – это тот случай, когда решебник приносит пользу, а не вред образовательному процессу. При правильном использовании можно добиться впечатляющих результатов. Главное, не злоупотреблять списыванием верных ответов без предварительного разбора условия упражнения, заданного преподавателем. Если соблюсти такие нюансы и преимущественно использовать онлайн-решебник для работы над ошибками, удастся превосходно освоить все параграфы из учебно-методического комплекта автора Афанасьева.

Важность освоения английского

Английский важно изучать внимательно и с полной самоотдачей. В будущей взрослой жизни приобретенные в детстве знания и навыки в лингвистической области обязательно окажутся полезны. Английский является не просто международным средством общения, но и самым распространенным деловым языком. Это значит, что при приеме на престижную высокооплачиваемую должность знание британского диалекта обязательно учитывается работодателем, и хороший уровень иностранного международного коммуникативного навыка сыграет на руку претенденту.

Михеева С.А. Методическое пособие к учебнику Экономика. Углубленный уровень 10-11 классы под ред. Иванова С.И. Часть 2


Михеева С. А. Методическое пособие к учебнику: под ред. С.И. Иванова, Л.Я. Линькова «Экономика». (Основы экономической теории). Углубленный уровень. Для 10-11 классов общеобразовательных организаций / С.А. Михеева. — В 2-х частях. Часть 2. — М.: ВИТА-ПPECC, 2018.
Пособие подготовлено строго в соответствии с содержанием учебника и практикума, входящих в УМ К. Основная цель — оказание методической помощи учителю в разработке и проведении уроков, отвечающих требованиям ФГОС среднего общего образования, а также в организации различных форм внеурочной деятельности по экономике в старших классах, изучающих экономику на углубленном уровне.
Основной акцент сделан на формировании у школьников устойчивой мотивации к изучению экономики, усвоении ими модели рационального экономического поведения, развитии экономического мышления, готовности к саморазвитию и самообразованию.

По каждой теме приведены основные изучаемые понятия, технологическая карга движения в теме, планируемые результаты обучения и методические рекомендации ко всем урокам. Описаны уроки разных типов, моделирующие игры и упражнения, обязательные и добровольные домашние задания. Подробно раскрыты основные виды деятельности учащихся на уровне учебных действий. Разработана система заданий на достижение учащимися предметных, метапредметных и личностных результатов. Даны темы экономических эссе, конференций, дискуссий, проектов, а также рекомендации к их содержанию и оформлению.
СОДЕРЖАНИЕ
Предисловие……………………………………………………………………….6
Учебно-тематический план………………………………………………………10
ТЕМА 10. ИЗМЕРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ. ОСНОВНЫЕ МАКРОЭКОНОМИЧЕСКИЕ
ПОКАЗАТЕЛИ……………………………………………………………………12
Урок 1. Валовой внутренний продукт…………………………………………..13
Урок 2. Методы исчисления ВВП………………………………………………..14
Урок 3. Решение задач и выполнение упражнений……………………………..15
Урок 4. Национальный доход…………………………………………………….16
Урок 5. Номинальный и реальный ВВП…………………………………………17
Урок 6. Решение задач и выполнение упражнений……………………………18
Урок 7. ВВП и качество жизни населения………………………………………19
Ответы и решения к заданиям практикума………………………………………20
ТЕМА 11. ЭКОНОМИЧЕСКИЙ РОСТ И ЭКОНОМИЧЕСКОЕ РАЗВИТИЕ……………….24
Урок 1. Экономический рост и его измерение………………………………..24
Урок 2. Факторы экономического роста. Экономическое развитие ……….26
Урок 3. Решение задач и выполнение упражнений……………………………27
Урок 4. Экономический рост в России……………………………………….27
Ответы и решения к заданиям практикума…………………………………..28
ТЕМА 12. СОВОКУПНЫЙ СПРОС И СОВОКУПНОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ. МАКРОЭКОНОМИЧЕСКОЕ РАВНОВЕСИЕ…………..30
Урок 1. Совокупный спрос и совокупное предложение………………………30
Урок 2. Доход, потребление и сбережения. Функция потребления…………31
Урок 3. Сбережения и инвестиции. Мультипликатор……………………….32
Урок 4. Решение задач и выполнение упражнений…………………………33
Урок 5. Потребительские расходы и сбережения домашних хозяйств в России………………..34
Ответы и решения к заданиям практикума…………………………………..34
ТЕМА 13. ЭКОНОМИЧЕСКИЙ ЦИКЛ. ЭКОНОМИЧЕСКИЕ КРИЗИСЫ. ЗАНЯТОСТЬ И БЕЗРАБОТИЦА …………37
Урок 1. Экономический цикл…………………………………………………..38
Урок 2. Длинные циклы экономической динамики…………………………..39
Урок 3. Занятые и безработные…………………………………………………40
Урок 4. Причины и формы безработицы ……………………………………41
Урок 5. Последствия безработицы и государственное регулирование занятости………..42
ТЕМА 14. ДЕНЬГИ И БАНКОВСКАЯ СИСТЕМА ………………………….49
Урок 1. Роль и функции денег в экономике…………………………………..50
Урок 2. Виды денег и их свойства ……………………………………………52
Урок 3. Коммерческие банки…………………………………………………..54
Урок 4. Потребительский кредит……………………………………………….55
Урок 5. Решение задач и выполнение упражнений…………………………..56
Урок 6. Центральный банк………………………………………………………57
Урок 7. Платежеспособность населения по кредитам ……………………..58
Ответы и решения к заданиям практикума ………………………………..58
ТЕМА 15. ИНФЛЯЦИЯ ………………………………………………………62
Урок 1. Инфляция и ее измерение……………………………………………..62
Урок 2. Причины и виды инфляции ………………………………………….65
Урок 3. Формы инфляции ……………………………………………………..66
Урок 4. Решение задач и выполнение упражнений …………………………67
Урок 5. Последствия инфляции………………………………………………..67
Урок 6. Инфляция в России ……………………………………………………68
Ответы и решения к заданиям практикума ………………………………..69
ТЕМА 16. ГОСУДАРСТВЕННОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ ЭКОНОМИКИ……72
Урок 1. Государственный бюджет……………………………………………..73
Урок 2. Бюджетно-финансовая политика……………………………………..77
Урок 3. Государственный долг…………………………………………………78
Урок 4. Решение задач и выполнение упражнений …………………………80
Урок 5. Кредитно-денежная (монетарная) политика…………………………80
Урок 6. Решение задач и выполнение упражнений ………………………..81
Ответы и решения к заданиям практикума ………………………………..82
ТЕМА 17. МЕЖДУНАРОДНАЯ ТОРГОВЛЯ И ВАЛЮТНЫЙ РЫНОК……85
Урок 1. Международное разделение груда и глобализация………………….86
Урок 2. Современная структура мирового хозяйства………………………..87
Урок 3. Международная торговля ……………………………………………..88
Урок 4. Решение задач и выполнение упражнений ………………………….89
Урок 5. Внешнеторговая политика ……………………………………………90
Урок 6. Валютный рынок ………………………………………………………93
Урок 7. Мировая валютная система ………………………………………….94
Урок 8. Перспективы резервных валют …………………………………….95
Ответы и решения к заданиям практикума ………………………………..96
ТЕМА 18. МЕЖДУНАРОДНОЕ ДВИЖЕНИЕ КАПИТАЛОВ. ПЛАТЕЖНЫЙ БАЛАНС. МЕЖДУНАРОДНАЯ ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ИНТЕГРАЦИЯ…..102
Урок 1. Международный рынок ссудного капитала ………………………103
Урок 2. Международный рынок предпринимательского капитала ………106
Урок 3. Платежный баланс …………………………………………………..107
Урок 4. Решение задач и выполнение упражнений ………………………108
Урок 5. Международная экономическая интеграция ……………………..108
Урок 6. Россия на мировом рынке капитала ……………………………109
Ответы и решения к заданиям практикума ……………………………….110
ОТВЕТЫ И РЕШЕНИЯ К ЗАДАНИЯМ РАБОЧЕЙ ТЕТРАДИ (Часть 2) …………………113
Рекомендации к содержанию и оценке эссе …………………………….143
Методические рекомендации к организации и проведению учебных конференций по результатам проектной деятельности ………………145
Список рекомендуемой литературы ………………………146

Фрагмент книги

Классы — Российская электронная школа

10 класс

ПОПУЛЯРНЫЕ УРОКИ

Выберите предметАлгебра и начала математического анализаАнглийский языкБиологияГеографияГеометрияЕстествознаниеИнформатикаИспанский языкИсторияЛитератураНемецкий языкОбществознаниеОсновы безопасности жизнедеятельностиПравоРоссия в миреРусский языкФизикаФизическая культураФранцузский языкХимияЭкологияЭкономика

Физическая культура

Показать ещё

Афанасьева Михеева 2 года обучения. Почему стоит его использовать

Данный продукт не является электронным учебником (разработан в соответствии с требованиями приказа Минобрнауки России № 1559 от 08.12.2014). Это точная копия печатного руководства в формате PDF. Не содержит мультимедийных и интерактивных объектов.

Учебник, созданный известными специалистами в области преподавания английского языка Афанасьевой О.В. и Михеевой И.В., предназначен для учащихся общеобразовательных школ и является основным компонентом учебно-методического пакета второго года обучения, который также включает в себя две рабочие тетради, книгу для чтения, книгу для учителя и аудиоприложение.Учебник переработан в соответствии с требованиями ФГОС «Основное общее образование», утвержден РАО и РАН и рекомендован Минобрнауки России … (CD входит только в печатное издание. .)

На нашем сайте вы можете скачать книгу «Английский … 2 курс. 6 класс» Михеева Ирина Владимировна бесплатно и без регистрации в форматах fb2, rtf, epub, pdf, txt, прочитать книгу онлайн или купите книгу в интернет-магазине.

Блокноты

являются неотъемлемой частью УМК-2, созданной известными специалистами в области преподавания английского языка О.В. Афанасьевой и И.В. Михеевой. Они предназначены как для самостоятельной работы студентов дома, так и на уроках.
В комплект также входят учебник, книга для чтения, книга для учителя и набор аудиокассет.

Примеры.
Прочтите, что Энн не любит делать, и напишите, что вам не нравится.
1) Энн ненавидит мыть тарелки.
2) Энн ненавидит ходить по магазинам.
3) Энн ненавидит готовить.
4) Энн ненавидит бегать.
5) Энн ненавидит петь.
6) Энн ненавидит играть на пианино.
7) Энн ненавидит плавание.
8) Энн ненавидит ложиться спать в десять часов вечера.

Прочтите текст и решите, какие фразы после текста соответствуют его содержанию, а какие нет.
Знакомьтесь, мой сын
Привет! Му зовут Полли Скотт. Я из Лидса. У меня есть сын, его зовут Робин. Робин не ходит в школу. Он студент. Робин любит музыку и книги.Он много читает. Робин не очень любит спорт. Обычно он не бегает и не прыгает. Иногда играет в футбол, но не очень часто. Обычно он не играет в теннис. Он никогда не ездит на лошадях. Робин ненавидит ходить в кино и смотреть телевизор. Но он хороший мальчик, и я его очень люблю.

Содержание
Раздел 1. Раздел 1
I. Прослушивание +
II. Чтение +
III. Письмо +
Тест 1
Диктовка 1
Работа над проектом 1
Раздел 2.Раздел 2
I. Прослушивание 4 +
II. Чтение 4 +
III. Письмо +
Тест 2
Диктовка 2
Проектная работа 2
Раздел 3, Раздел 3
I. Аудирование +
II. Чтение +
III. Письмо +
Тест 3
Диктовка 3
Проектная работа 3
Раздел 4. Раздел 4
I. Аудирование 4 +
II. Чтение 4 +
III. Writing +
Test 4
Dictation 4
Project Work 4.


Скачайте бесплатно электронную книгу в удобном формате, смотрите и читайте:
Скачать книгу Английский язык, 6 класс, 2 года обучения, Рабочая тетрадь №1, Афанасьева О.В., Михеева И.В., 2006 — файловкачат.com, быстрая и бесплатная загрузка.

  • — Учебник, созданный известными специалистами в области преподавания английского языка, является основной составляющей учебно-методического комплекса для 6-го класса. Учебник подходит всем … Книги по английскому языку
  • Английский язык, 6 класс, Афанасьева О.В., Михеева И.В., 2014- Учебник, созданный известными специалистами в области преподавания английского языка О.В. Афанасьевой и И.В. Михеевой, предназначен для студентов общеобразовательная … Книги по английскому языку
  • Английский язык, 6 класс, часть 2, Афанасьева О.В., Михеева И.В., Баранова К.М., 2014 Английский язык
  • Английский язык, 6 класс, часть 1, Афанасьева О.В., Михеева И.В., Баранова К.М., 2014- Учебник, созданный известными специалистами в области преподавания английского языка, предназначен для школьников и является основным компонентом учебно-методического комплекса по … Книги на английском языке

Следующие учебные пособия и книги:

  • English, Grade 5, Happy English.ru, Happy English.ru, Kaufman K.I., Kaufman M.Ю., 2008- УМК «Happy English.ru» для 5 класса предназначено для образовательных учреждений на начало обучения с 5 класса. УМК «Happy English.ru» соответствует … Английский книги
  • Английский язык, 3 класс, г. Enjoy English-2, Part 1, Биболетова М.З., Денисенко О.А., Добрынина Н.В., Трубанева Н.Н., 2006- Enjoy English-2 (Часть 1, Часть 2) — продолжение курса английского языка для начальных классов учебных заведений Enjoy English 2 (Часть … Книги по английскому
  • Английский язык, 30 типовых вариантов экзаменационных работ для подготовки к ЕГЭ, Музланова Е.С., 2014- Цель пособия — помочь ученикам 10-11 классов и поступающим в кратчайшие сроки подготовиться к итоговой оценке по английскому языку в … Английский книги
  • Практическая грамматика английского языка, Карпышева Н.М. , Янушков В.Н., 2005- Эта книга представляет собой курс грамматики современного английского языка. Это для тех, кто хочет основательно выучить английский, но не … Книги на английском языке

Предыдущие статьи:

  • Пой и играй, Сборник песен для начальной школы, 1997 — Сборник из 44 песен и игр на английском языке, адресованный дошкольникам и детям младшего школьного возраста… Лирика легкая … Английские книги
  • Развитие урока английского языка, 4 класс, Дзюина Е.В., 2013- В пособии представлены подробные сценарии уроков английского языка в 4 классе для учителей, работающих по учебно-методическому комплексу М.З. Биболетова и … Английские книги
  • Английский язык, 7 класс, Афанасьева О.В., 2012- Учебник является основным компонентом учебно-методического комплекса английского языка и предназначен для учащихся VII класса общеобразовательных учреждений и школ с углубленным изучением английского языка. … Книги на английском языке
  • Библия деловых писем, факсов и электронной почты на английском языке, Walden DK, 2004 — Как отправить запрос, попросить отправить каталог, прайс-лист, брошюру, задать вопросы и обсудить технические детали изделия, запросить образцы, демонстрационные модели. Как… Английские книги

В шестой класс школьная программа по такому предмету как Английский язык усложняется. Здесь достаточно сложных тем, таких как дом, внешний вид, здоровье, выбор будущей профессии… Чтобы лучше их понять, рекомендуется использовать Решебник к учебнику. «Учебник английского языка для 6 класса (2 курс) Афанасьев, Михеев, Дрофа Новый курс» .

Что можно сделать с помощью Решебника

С помощью «ГДЗ на английском, 6 класс Афанасьев» ученик может сделать следующее:

  • Проверить правильность выполнения домашнего задания самостоятельно.
  • Проанализировать допущенные ошибки.
  • Повышение успеваемости.

Зачем его использовать

IN 6 класс на английском языке набор довольно больших объемов. Количество информации становится просто огромным, и школьникам часто очень трудно ее запомнить. Если некоторые аспекты ускользают от внимания детей, у них будут пробелы в понимании предмета. Чтобы этого не произошло, следует использовать Решебник к учебнику «Английский язык 6 класс Фанасьева, Михеева Новый курс» … Помогает родителям существенно сэкономить время на разного рода домашние дела, ведь им не нужно проверять уроки своих детей.

Что изучается в этом году.

Дети учатся говорить о своем доме, обсуждаются вопросы внешнего вида, здоровья и будущей профессии. Грамматические аспекты самые сложные. Хорошего понимания материала можно добиться, применив Решебник к учебнику «Английский язык 6 класс (серия« Новый курс ») Афанасьева, Михеева онлайн, в котором даны подробные решения всех текущих вопросов.

Пособие состоит из восьми тематических разделов.Кроме того, я слушаю, как школьники предложили восемь диктантов, которые дети напишут в этом году. В ГДЗ на английском языке, 6 класс Афанасьева содержатся исчерпывающие ответы по всем пунктам, поэтому проверить ф / с и детально проанализировать допущенные ошибки будет крайне легко.

Почему вы должны это использовать.

Довольно большой объем информации и очень сложная грамматика довольно часто ставят учеников в неприятное положение, так как очень сложно запомнить огромный объем информации.Из-за того, что некоторые аспекты ускользают от внимания детей, у них может снизиться успеваемость и развиться общее непонимание дисциплины. Однако ситуацию достаточно легко исправить, если под рукой есть справочник по учебнику. «Английский язык 6 класс (серия« Новый курс »)» Афанасьева.

рабочих тетрадей по английскому языку. Как правильно написать «домашнее задание» на английском языке? Инструкция по написанию

7 класс
Учебник английского языка для 7 классов.Учебник., Кузовлев В.П.
8 класс
англ. Happy English 2, 7-9 класс, Т. Клементьева, Ю.А. Шеннон
англ. Happy English 2. Книга для чтения, 7-9 классы, Клементьева Т.Б., Я.А. Шеннон
англ. Happy English 2. Рабочая тетрадь 1, 7-9 класс, Т. Клементьева, Ю.А. Шеннон
англ. Happy English 2. Рабочая тетрадь 2, 7-9 классы, Т. Клементьева, Ю.А. Шеннон
Английский язык 8 класс. Английский язык нового тысячелетия.Деревянко Н.Н.
Учебник английского языка для 8 классов. Учебник., Кузовлев В.П.
Английский язык 8 класс, Старкс
9 класс
англ. Happy English 2, 7-9 класс, Т. Клементьева, Ю.А. Шеннон
англ. Happy English 2. Книга для чтения, 7-9 классы, Клементьева Т.Б., Я.А. Шеннон
англ. Happy English 2. Рабочая тетрадь 1, 7-9 класс, Т. Клементьева, Ю.А. Шеннон
англ. Happy English 2. Рабочая тетрадь 2, 7-9 классы, Т.Клементьева Б., Я.А. Шеннон
Учебник английского языка для 9 классов. Учебник., Кузовлев В.П.
10 класс
11 класс
англ. Happy English 3. Рабочая тетрадь 1, 10–11 классы, T.B. Клементьева, Ю.А. Шеннон
англ. Happy English 3. Рабочая тетрадь 2, 10-11 класс, Т. Клементьева, Ю.А. Шеннон
англ. Happy English 3. Рабочая тетрадь 3, 10–11 классы, T.B. Клементьева, Ю.А. Шеннон

Домашнее задание по английскому языку для любого школьника — задача не из легких.Сам английский язык считается одним из самых простых для изучения иностранных языков, это намного проще, если сравнить его, например, с русским языком. Неслучайно на нем говорит почти половина мира. Но все же при изучении английского в школе возникает множество трудностей.

GDZ на английском языке это волшебная палочка, которая может в трудную минуту. Для подготовки к английскому языку доступно множество учебников. Это такие авторы, как В.П. Кузовлев, Лапа, Э.Ш. Перегудова, Т. Клементьева, Ю.А. Шеннон. Любой из этих уроков поможет вам научиться общаться на английском языке. Поможет найти решение любой проблемы и выполнить домашнее задание по английскому.

Многие часто спрашивают: «Сколько времени нужно, чтобы выучить английский?» Однозначного ответа быть не может. В одних школах изучение языка начинается со 2 класса, в других — с 5 класса. В 11 классе обучение также не заканчивается. Это продолжается даже после окончания школы — в университете, институте.Одно можно сказать наверняка, если использовать gdz на английском языке, то времени на выполнение домашнего задания будет намного меньше. Но прибегать к помощи ГДЗ нужно тогда, когда ученик действительно испытывает трудности, а не каждый раз, когда дома задают домашнее задание.

Современные учебные пособия — это не только учебники. Есть и книги для чтения, и рабочие тетради, например, как у Клементьевой с серией Happy English для разных классов. Если есть возможность, вы можете послушать радио или использовать Интернет, чтобы максимально погрузиться в окружающую среду, для лучшего усвоения языка, или использовать GDZ на английском языке.

В нашей базе GDZ на английском языке есть готовые задания для школьников с 5 по 11 класс. Также есть мобильная версия сайта, созданная специально для доступа с телефонов и смартфонов. Доступ к каталогу GDS на английском языке абсолютно бесплатный и без смс.

Добро пожаловать на наш сайт, Друзья!

Изображения обложек учебников представлены на страницах сайта исключительно в качестве иллюстративного материала (ст. 1274 п.1 части четвертой ГК РФ)

  • Английский язык 3 класс.Английский язык 3. Учебник. Биболетова АСТ
  • Английский язык 3 класс. Rainbow English 3: Учебник — Учебное пособие. Часть 1, 2. ФГОС Афанасьева, Михеева Дрофа
  • Английский язык 3 класс. В центре внимания 3: Тестовый буклет. ФГОС Быкова, Дули Просвещения
  • Английский язык 3. Учебное пособие. Учебное пособие. Обе части Верещагин, Притыкина Просвещение
  • В центре внимания 4 класс.Студенческая книга Кузовлева, Перегудова Образование
  • Английский язык 4 класс. Starlight: Студенческая книга. ФГОС Баранова, Дули Просвещения
  • Английский язык 5 класс. Rainbow English 5: Учебник — Учебное пособие. Часть 1, 2. ГЭФ Дрофа
  • В центре внимания 5. Учебник — Студенческая книга Ваулина, Дули, Подолянко Образование
  • Английский язык 5 класс. Студенческая книга Кузовлева Просветление
  • Наслаждайтесь английским языком 5. Студенческая книга. ФГОС Биболетова Звание
  • Английский язык 6 класс.Rainbow English 6: Учебник — Учебник для учащихся. ФГОС Афанасьева, Михеева, Баранова Дрофа
  • В центре внимания 6. Учебное пособие — Учебное пособие. ФГОС Ваулина, Дули Просвещение
  • Английский язык 6. Звездный свет: Учебное пособие. ФГОС Баранова Просвещение
  • Английский язык 6. Учебник. ФГОС Кузовлева, Лапа Просвещение
  • Английский язык 6. Классный английский 6. Учебник. Биболетова, Денисенко Звание
  • Английский язык 7 класс.Rainbow English 7: Учебник — Учебник для учащихся. Часть 1, 2 Афанасьева, Михеева, Баранова Дрофа
  • Английский класс 7. Учебник ученика. ФГОС Кузовлева, Лапа Просвещения
  • Английский класс 7. Звездный свет: Учебник ученика. ФГОС Баранова Просвещение
  • Английский язык 7 класс. В центре внимания 7: Учебник — Учебное пособие Ваулина, Дули Просвещение
  • Английский язык 7 класс. Учебник — Учебное пособие. Биболетова Название
  • Английский 8 класс.Книга ученика. ФГОС Кузовлева, Лапа, Перегудова Образование
  • Английский язык 8 класс. В центре внимания 8: Учебник — Книга ученика Ваулина, Дули Просвещение
  • Английский язык 8 класс. Enjoy English 8: Учебник ученика. ФГОС Биболетова Название
  • Английский язык 9 класс Кузовлев, Лапа, Перегудова Образование
  • Английский язык 9 класс. Английский язык New Millennium. Студенческая книга Butler, Thunderstorm Title
  • ГДЗ по английскому языку 10 класс В.П. Кузовлев, Н.М. Лапа
  • Английский язык 10 кда.Учебник ученика. ФГОС Афанасьева, Михеева Образование
  • Happy English.ru 10 класс. Книга ученика — Рабочая тетрадь № 1 и № 2 Кауфман, Кауфман Название
  • Английский язык 10 класс. Наслаждайтесь английским. Книга ученика — Рабочая тетрадь 1 — Рабочая тетрадь 2 Биболетова Заголовок
  • Английский язык 10 класс. Английский язык нового тысячелетия. Книга ученика Гроза, Батлер Заголовок
  • Английский язык 11 класс В.П. Кузовлев М.: Образование
  • Английский язык-XI: Учебное пособие — Рабочая тетрадь Афанасьева О.В., Михеева И.В. М .: Education
  • Enjoy English 11 класс. Тетрадь ученика — Рабочая тетрадь 1 — Рабочая тетрадь 2 Биболетова М.З., Бабушис Е.Е. Обнинск: Title
  • Контрольно-измерительные материалы (КИМ) на английском языке, 4 класс. ФГОС Кулинич Вако
  • Контрольно-измерительные материалы (КИМ) на английском языке, 5 класс. ФГОС Лысакова Вако
  • Контрольно-измерительные материалы (КИМ) на английском языке, 6 класс. ФГОС Сухоросова Вако
  • Контрольно-измерительные материалы (КИМ) на английском языке, 7 класс.ФГОС Артюхова Вако
  • Контрольно-измерительные материалы (КИМ) на английском языке, 8 класс. ФГОС Лысакова Вако
  • Контрольно-измерительные материалы (КИМ) на английском языке, 9 класс.

Рабочие тетради

  • Рабочая тетрадь по английскому языку, 2 класс. Рабочая тетрадь Кузовлева Просвещение
  • Рабочая тетрадь по английскому языку, 2 класс. В центре внимания Быкова Просветление
  • Рабочая тетрадь по английскому языку 2 класс Азарова, Дружинина Название
  • Рабочая тетрадь по английскому языку, 2 класс.Enjoy English Title
  • Рабочая тетрадь по английскому языку, 2 класс. Часть 2 Барашкова. К учебнику Верещагиной Экзамен
  • Рабочая тетрадь по английскому языку для 3 класса Верещагина И.Н. Т.А. Притыкина
  • Рабочая тетрадь по английскому языку для 3 класса. Рабочая тетрадь Кузовлева
  • Рабочая тетрадь по английскому языку для 3 класса. Часть 1 Барашкова Е.А.
  • Рабочая тетрадь по английскому языку для 3 класса. В центре внимания 3: Тестовый буклет Быкова
  • Рабочая тетрадь по английскому языку для 3 класса. Rainbow English. ФГОС Афанасьева Михеева Дрофа
  • Рабочая тетрадь по английскому языку 3 класс.В центре внимания 3 рабочая тетрадь Быкова Н.И., Дули Д., Поспелова М.Д. М .: Education, 2015-2014
  • Рабочая тетрадь по английскому для 3 класса. Enjoy English. ФГОС Биболетова, Денисенко, Трубанева Название
  • Рабочая тетрадь по английскому языку для 4 класса. Рабочая тетрадь. ФГОС Кузовлева Просвещение
  • Рабочая тетрадь по английскому языку для 4 класса. В центре внимания. ФГОС Быкова, Дули, Поспелова Просвещение
  • Рабочая тетрадь по английскому языку для 4 класса. Звездный свет. Часть 1. ФГОС Баранова, Дули Просвещения
  • Рабочая тетрадь по английскому языку для 4 класса.ФГОС Комарова, Ларионова Русское слово
  • Рабочая тетрадь по английскому для 4 класса. Enjoy English. ФГОС Биболетова, Денисенко, Трубанева Название
  • Рабочая тетрадь по английскому языку 5. Учебное пособие по английскому языку 5. Рабочая тетрадь по английскому языку 5 класс . Рабочая тетрадь. ФГОС Кузовлева Просвещение
  • Рабочая тетрадь по английскому языку 5. В центре внимания 5: Рабочая тетрадь.ФГОС Ваулина, Dooley Enlightenment
  • Рабочая тетрадь на английском языке для 5 класса. Часть 1, 2. ФГОС Кауфмана Title
  • Рабочая тетрадь на английском языке для 5 класса. Наслаждайтесь английским языком. ФГОС Биболетова Заглавие, Трубанева
  • Рабочая тетрадь по английскому языку для шестого класса. В центре внимания 6: Тестовый буклет Ваулина Джулия, Вирджиния Эванс, Дженни Дули, Ольга Подоляко
  • Рабочая тетрадь по английскому языку 6. Enjoy English 6. Рабочая тетрадь Biboletova Bustard
  • Рабочая тетрадь по английскому языку 6. Rainbow English 6: Activity Book Афанасьева, Михеева, Баранова Дрофа
  • Рабочая тетрадь по английскому языку для 6 класса.Рабочая тетрадь Кузовлева, Лапа Просвещения
  • Рабочая тетрадь по английскому для 6 класса. Звездный свет. Рабочая тетрадь Баранова Просветление
  • Рабочая тетрадь по английскому языку для шестого класса. В центре внимания 6: Рабочая тетрадь. ФГОС Ваулина Просветление
  • Рабочая тетрадь на английском для 6 класса. ФГОС Комарова, Ларионова Русское слово
  • Рабочая тетрадь на английском для 6 класса. Enjoy English. ФГОС Биболетова, Денисенко Титул
  • Рабочая тетрадь по английскому языку 6. Часть 1 Кауфман Титул
  • Рабочая тетрадь по английскому языку 6 класс.Часть 2 Kaufman Title
  • Рабочая тетрадь по английскому языку 7. Enjoy English 7. Рабочая тетрадь Biboletova Bustard
  • Рабочая тетрадь по английскому языку 7. Rainbow English 7: Activity Book Афанасьева, Михеева, Баранова Bustard3
  • Рабочая тетрадь по английскому для 7 класса. Starlight Baranova Enlightenment
  • Рабочая тетрадь по английскому языку 7. Рабочая тетрадь Kuzovlev Enlightenment
  • Рабочая тетрадь по английскому языку 7. Enjoy English 7. ФГОС Рабочая тетрадь по английскому языку для 8 класса. Часть 1, 2 Рабочая тетрадь по английскому для 8 класса.Рабочая тетрадь Starlight на английском языке для 8 класса. В центре внимания 8: Рабочая тетрадь. FGOS Учебное пособие по английскому для 8 класса. Часть 2 Учебное пособие по английскому для 9-го класса (зеленые и синие обложки) Учебное пособие по английскому для 9-го класса Учебное пособие по английскому для 10-го класса. ФГОС «Гроза, дворецкий» Название
  • Рабочая тетрадь на английском языке для 11 класса. В центре внимания 11: Рабочая тетрадь Вирджиния Эванс, Дженни Дули, Боб Оби, Ольга Афанасьева, Ирина Михеева

Эффективное изучение английского языка с GDZ

  • Изучение английского языка — одна из тех задач, которые ученики обязательно будут решать в рамках средней школы и после нее.Это особенно актуально и актуально после введения ФГОС, который устанавливает обязательное обучение двух иностранных учащихся в рамках школьной программы … В связи с этим английский как основной или дополнительный язык изучается во всех школах. страны без исключения. Справиться с этой задачей, максимально грамотно ее решить помогут качественные туториалы и решебники к ним.
  • Подобрать подходящий комплект и начать занятия на GDZ можно в любом классе школы.В начальной школе учителя-предметники, родители, наставники и руководители языковых курсов и кружков могут помочь ученикам решить эту проблему. Впоследствии ученики средних и старших классов смогут справиться с этой задачей самостоятельно. В любом случае, при организации такого тренинга по сборникам готовых домашних заданий следует сосредоточиться на:
    — своих задачах и целях — «подтянуть» знания и получить более высокий текущий и итоговый балл по английскому, подготовиться и участвовать, побеждать в языковом обучении. соревнования и соревнования, проводимые на внешкольных и школьных площадках, сдачу ОГЭ / ЕГЭ по дисциплине в выпускных классах;
    — базовый уровень знаний, возможность привлечения дополнительной помощи и ее потребность, ответственность, интерес к предмету, целеустремленность;
    — количество времени, которое можно и будет потратить на эффективное и действенное обучение.
  • Основные принципы работы с коллекциями:
    — согласованность;
    — сложность;
    — составление качественного комплекта учебной литературы;
    — штатная работа;
    — самопроверка, самоконтроль результатов, корректировка планов, выявление проблем, отслеживание динамики результатов.
  • Среди полезной литературы, помимо основных учебников в рамках прикладной программы, учебные материалы на английском языке называются:
    — рабочие тетради по дисциплине;
    — тетради по предмету;
    — КИМ на английском языке;
    — другие собрания мастерских.
    Среди самых популярных авторов среди школьников и их учителей — Дули, Биболетова, Дворецкая, Афанасьева, Баранова, Лапа, Кузовлев, Кауфман и другие.
  • Некоторые из представленных сборников универсальны, подходят для любых учебных материалов на английском языке, другие идут с мастер-классами для лучшего и более полного, глубокого усвоения материала курса.

Правильное составление домашнего задания Английский язык играет важную роль в оценке. Каждый студент университета, частной или государственной школы должен уметь делать это правильно.Учителя обучают правилам написания домашних заданий с младших классов. Но многие не придают этому большого значения, поэтому забывают и начинают искать перевод в Интернете или допускают смешные ошибки.

Инструкция по написанию

  1. Число нужно писать посередине строки.
  2. Если страница пуста, начните писать с самой верхней строки.
  3. Если на странице записной книжки на английском языке уже есть заметки, отступите от 2 строк или 4 ячеек, в зависимости от типа записной книжки.
  4. Дата указывается следующим образом: день недели, день, месяц

Пример: пятница, 13 сентября, где 10-е — сокращенное обозначение десятого.

Перевод: пятница, 13 (тринадцатое) сентября.

Иногда дату написания упрощают и пишут так: 13 сентября.

Перевод: 13 (тринадцатое) сентября.

  1. После даты письменно указывается вид работ:

Учебная работа.Классная работа.

Домашнее задание. Домашнее задание.

В нашем случае это второй вариант. Слово пишется под датой, также в середине строки.

Все просто и легко.

В конце необходимо отметить, что словосочетание «домашнее задание» в английском языке обозначается одним словом «домашнее задание». Слово состоит из двух корней «Дом» — дом и «Работа» — работа. Довольно часто слово пишется отдельно — «Дом» и «Работа», при этом допустив серьезную ошибку. Так что помните: слово «домашнее задание» всегда пишется вместе!

Ленватиниб второй линии у пациентов с рецидивирующим раком эндометрия

Задача: В этом исследовании оценивалась эффективность ленватиниба, многоцелевого ингибитора тирозинкиназы, в качестве терапии второй линии у пациентов с неоперабельным раком эндометрия.Первичной конечной точкой была частота объективного ответа (ЧОО), оцененная независимым радиологическим обзором (ВСР). Вторичные конечные точки включали медианную выживаемость без прогрессирования (PFS), общую выживаемость (OS) и коэффициент клинической пользы. Исследовательские конечные точки оценивали связь исходных уровней биомаркеров в плазме (50 циркулирующих цитокинов и / или ангиогенных факторов, измеренных с помощью иммуноанализа) с результатами эффективности.

Методы: Было проведено международное открытое одноранговое многоцентровое исследование фазы 2.У подходящих пациентов был гистологически подтвержденный неоперабельный рак эндометрия, который рецидивировал после 1 предшествующей системной химиотерапии на основе платины. Пациенты получали ленватиниб 24 мг перорально один раз в сутки в течение 28-дневного цикла приема.

Результаты: В исследовании приняли участие 133 пациента. Согласно IRR, у 19 пациентов был подтвержденный объективный ответ на ORR 14,3% (95% ДИ: 8,8–21,4). Долговременное стабильное заболевание (≥23 недель) наблюдалось у 31 пациента (23.3%), а показатель клинической пользы составил 37,6% (95% ДИ: 29,3–46,4). Медиана ВБП составила 5,6 месяца (95% ДИ: 3,7–6,3), а медиана ОВ — 10,6 месяцев (95% ДИ: 8,9–14,9). Наиболее частыми (любой степени) нежелательными явлениями, связанными с лечением, были усталость / астения (48%), гипертония (49%), тошнота / рвота (32%), снижение аппетита (32%) и диарея (31%). Более низкие исходные уровни ангиопоэтина-2 были связаны с более длительными PFS, OS и более высоким ORR.

Выводы: Пациенты с рецидивирующим раком эндометрия, получавшие ленватиниб второй линии, проявляли умеренную противоопухолевую активность, и лечение в целом хорошо переносилось с профилем безопасности, соответствующим предыдущим исследованиям.

Ключевые слова: Рак эндометрия; Ленватиниб; Ингибитор мультикиназы.

Изменение происхождения Иркутского угольного бассейна в течение ранней и средней юры: геохимические и Sm-Nd изотопные данные

  • Акулов Н.И., Фролов А.О., Мащук И.М., Акулова В.В. Иркутский осадочный бассейн, Стратигр. Геол. Коррел., 2015, т. 23, нет. 4. С. 387–409.

    Артикул Google Scholar

  • Бадмацыренова Р.А. Источники основного магматизма Западного Забайкалья в позднем палеозое (по геохимическим и изотопным данным) // Источники основного магматизма. Геол. Geophys. , 2011, т. 52, нет. 6. С. 631–640.

    Артикул Google Scholar

  • Донская, Т.В., Бибикова Е.В., Ковач В.П., Мазукабзов А.М. Петрогенезис постколлизионных гранитоидов раннего протерозоя в Южном Сибирском кратоне, Петрология, , 2005, т. 13, вып. 3. С. 229–252.

    Google Scholar

  • Донская Т.В., Бибикова Е.В., Гладкочуб Д.П. и др. Петрогенезис и возраст кислых вулканических пород Северо-Байкальского вулканоплутонического пояса, Сибирский кратон // Петрология, , 2008, вып.16, нет. 5. С. 422–447.

    Google Scholar

  • Донская Т.В., Гладкочуб Д.П., Мазукабзов А.М., Иванов А.В. Позднепалеозойско-мезозойский субдукционный магматизм на южной окраине Сибирского континента и 150-миллионная история Монголо-Охотского океана, Asian J. Earth Sci. , 2013, т. 62. С. 79–97.

    Артикул Google Scholar

  • Файнштейн, Г.Х., Юрская палеогеография Иркутского амфитеатра в связи с его экзогенным рудопроявлением, в Матер. По геологии и полезным ископаемым Сибирской платформы . М .: Недра, 1971. С. 55–68.

    Google Scholar

  • Федотова А.А., Разумовский А.А., Хаин Е.В. и др. Поздненеопротерозойские магматические комплексы западной части Байкало-Муйского пояса: этапы формирования, Геотектоника , 2014, т.48, вып. 4. С. 292–312.

    Артикул Google Scholar

  • Фор Г., Принципы изотопной геологии. Нью-Йорк: Уайли, 1986.

    Google Scholar

  • Фролов А.О., Ранне-среднеюрские растительные сообщества Иркутского угленосного бассейна : Автореф. Sci. (Геол.-минерал.) Дис. … Томск: Изд. Позитив-НБ, 2013.

    Google Scholar

  • Фролов, А.О., Мащук И.М., Аржанникова А.В. Первые палеоботанические находки в кудинской и тальцкой свитах (Иркутский угленосный бассейн) и их стратиграфическое значение // Матер. XXVI Всеросс. молодежной конф. «Строение литосферы и геодинамика», (Материалы XXVI Всероссийской молодежной конференции «Строение литосферы и геодинамика»), Иркутск: Ин-т. Zemn. Кори Сиб. Отд. Росс. Акад. НАУК, 2015. С. 204–205.

    Google Scholar

  • Гладкочуб Д.П., Донская Т.В., Вингейт М.Т.Д. и др. Использование изотопного датирования эндоконтактных гибридных пород для определения возраста основных пород (юг Сибирского кратона). Геол. Geophys. , 2013, т. 54, нет. 11. С. 1340–1351.

    Артикул Google Scholar

  • Гладкочуб Д.П., Донская Т.В., Редди С.М. и др. Рост земной коры от палеопротерозоя до эоархея в Южной Сибири: синтез изотопа неодима, Спец.Изд-во Геол. Soc. Лондон , 2009, т. 23. С. 127–143.

    Артикул Google Scholar

  • Гладкочуб Д.П., Мазукабзов А.М., Иванов А.В. Позднепалеозойско-мезозойский субдукционный магматизм на южной окраине Сибирского континента и 150-миллионная история Монголо-Охотского океана, Азиатский J Земляные науки. , 2013, т. 62. С. 79–97.

    Артикул Google Scholar

  • Гладков, А.С., Черемных А.В., Лунина О.В. Деформации юрских отложений южной окраины Иркутского амфитеатра. Геол. Геофиз., 2000, т. 41, № 2, с. 220–226.

  • Goldstein, S.J. и Якобсен, С.Б., изотопная систематика Nd и Sr водной взвеси в реках: последствия для эволюции земной коры, Earth Planet. Sci. Lett. , 1988, т. 87. С. 249–265.

    Артикул Google Scholar

  • Херрон, М.М., Геохимическая классификация терригенных песков и сланцев по керновым или каротажным данным, J. Отложения. Бензин. , 1988, т. 58. С. 820–829.

    Google Scholar

  • Jacobsen, S.B. и Вассербург Г.Дж. Sm – Nd-эволюция хондритов и ахондритов, Earth Planet. Sci. Lett. , 1984, т. 67. С. 137–150.

    Артикул Google Scholar

  • Киричкова, А.И., Быстрицкая Л.И., Травина Т.А. Значение Coniopteris и Czekanowskiales для стратиграфии юры континентальных отложений Западной Сибири // Стратиграфия. Геол. Коррел. , 2002, т. 10, вып. 3. С. 239–256.

    Google Scholar

  • Киричкова А.И., Костина Е.И., Быстрицкая Л.И., Фитостратиграфия и флора юрских отложений Западной Сибири, , С.СПб: Недра, 2005.

    Google Scholar

  • Ковач В., Сальникова Е., Ван, К.Л. и др., Возраст циркона и изотопные ограничения Hf на источники обломочных метаосадков Слюдянского высокосортного комплекса, юго-восточная Сибирь: последствия для роста континентов и эволюция Центральноазиатского орогенного пояса, Asian J. Earth Sci. , 2013, т. 62. С. 18–36.

    Google Scholar

  • Крейзель, Р., Методы палеоботанического исследования. Руководство для изучения ископаемых растений и образованных ими горных пород, . Л .: Изд. Акад. АН СССР, 1932 [в России].

    Google Scholar

  • Летникова Е.Ф., Кузнецов А.Б., Вишневская И.А. и др. Пассивная континентальная окраина венда в южной части Сибирского кратона: геохимические и изотопные (Sr, Sm – Nd) свидетельства и U – Pb датирование обломочного материала. цирконов методом ЛА – ИСП – МС // Физиология растений.Геол. Geophys. , 2013, т. 54, нет. 10. С. 1117–1194.

    Google Scholar

  • Литвиновский Б.А., Борминь Ян, Занвилевич А.Н. и др. Петрогенезис сиенит-гранитных свит Брянского комплекса (Забайкалье, Россия): значение для происхождения гранитоидных магм А-типа , Chem. Геол. , 2002, т. 189. С. 105–133.

    Google Scholar

  • Литвиновский, Б.А., Цыганков А.А., Ян Б.М. и др., Происхождение и эволюция перекрывающихся известково-щелочных магм: позднепалеозойская постколлизионная магматическая провинция Забайкалья (Россия), Lithos , 2011, т. 1125. С. 845–874.

    Артикул Google Scholar

  • Макрыгина В.А. , Петрова З.И. Геохимия метаморфических комплексов восточного побережья озера Байкал и их корреляция с породами западного побережья // Геохимия.Int. , 2005, т. 43, нет. 5. С. 438–455.

    Google Scholar

  • Маруяма, С., Исодзаки, Ю., Кимура, Г., и Терабаяси, М., Палеогеографические карты Японских островов: тектонический синтез плит с 750 млн лет до настоящего времени, Островная дуга , 1997, т. . 6. С. 121–142.

    Артикул Google Scholar

  • Маслов В.П. Лавров М.М. Материалы по геологии истока Ангары.Всесоюз. Геол.-развед. об. изд. НКТП СССР , 1933, т. 298.

  • Мотова З.Л., Гладкочуб Д.П., Станевич А.М. и др. Петрохимические характеристики неопротерозойских терригенных пород нижнего карагаса Бирюсско-Саянской области, Вестн. Иркутского гос. техн. ун-та, , 2015, № 3. (98), стр. 81–93.

    Google Scholar

  • Натальин Б. История и режимы мезозойской аккреции на Юго-Востоке России, Островная дуга , 1993, т.2. С. 15–34.

    Артикул Google Scholar

  • Неймарк Л.А., Ларин А.М., Немчин А.А. и др. Анорогенная природа магматизма Северного Байкальского вулканического пояса: данные геохимических, геохронологических (U – Pb) и изотопных (Pb, Nd) данные, Петрология , 1998. Т. 6, вып. 4. С. 124–148.

    Google Scholar

  • Никитина В.В. и Панаев В.А., Новые данные по юрской дабатской и байкальской фациям Иркутского бассейна // Геология и полезные ископаемые юга Сибирской платформы . Л .: Недра, 1970. С. 58. –68.

    Google Scholar

  • Объяснительная запись к Государственной геологической карте Российской Федерации шкала 1: 200000. Сер.Ангарская. Список N-48-XXXIII (Пояснительная записка к Государственной геологической карте Российской Федерации масштаба 1: 200000. Сер. Ангара. Лист N-48-XXXIII). Санкт-Петербург: Всеросс. Научно-Вып. Геол. Ин-т, 1999.

  • Парфенов Л.М., Попенко Л.И., Томуртогоо О. Проблемы тектоники Монголо-Охотского орогенного пояса // Тихоокеан. Геол. , 2001, № 16. С. 797–830.

    Google Scholar

  • Плоскогорья и низменности Восточной Сибири.История развития религии Сибири и Дальнего Востока (Высокогорье и низменность Восточной Сибири. История рельефного освоения Сибири и Дальнего Востока) Под ред. Флоренсова Н.А., М .: Наука, 1971.

  • Пин К. и Залдуеги Ф.С. Последовательное разделение легких редкоземельных элементов, тория и урана с помощью миниатюрной экстракционной хроматографии: приложение к изотопному анализу силикатных пород, Anal. Чим. Acta , 1997, т. 339. С. 79–89.

    Google Scholar

  • Прокопьев, А.В., Хайме Т., Элизабет Л.М., Джордж Э.Г. Палео-Лена — 200 млн лет. трансконтинентального переноса циркона в Сибири, Геология , 2008, т. 36. С. 699–702.

    Артикул Google Scholar

  • Решения III Межведомственного регионального стратиграфического совета по мезозою и каинозою Средней Сибири .Конф. по мезозойским и кайнозойским толщам Средней Сибири), МСК СССР. Новосибирск, 1981.

  • Самылина В.А., Систематика рода Phoenicopsis, в Мезозойские растения (гинкговые и чекановские) Восточной Сибири (мезозойские растения (Ginkgoales and Czekanowskialesau, Нэдрамеевка, Москва, Ва. 1972, с. 44–81.

    Google Scholar

  • Сетон, М., Мюллер, Р.Д., Залирович, С., и др., Глобальные реконструкции континентальных и океанических бассейнов с 200 млн лет назад, Earth-Sci. Ред. , 2012 г., т. 113. С. 212–270.

    Артикул Google Scholar

  • Шохонова М.Н., Донская Т.В., Гладкочуб Д.П. и др. Палеопротерозойские базальтоиды Северо-Байкальского вулканоплутонического пояса Сибирского кратона: возраст и петрогенезис, Генетика. Геол. Geophys. , 2010, т. 51, нет. 8, стр.815–832.

    Артикул Google Scholar

  • Штельмах С.И., Черкашина Т.Ю., Пашкова Г.В. Рентгенофлуоресцентное определение микроэлементов в углеродистой породе и флюоритовой руде на спектрометре S8 TIGER, Anal. Контроль , 2015, т. 19, нет. 2. С. 121–129. doi doi 10.15826 / analitika.2015.19.2.001

    Google Scholar

  • Скобло В.М., Лямина Н.А., Руднев А.Ф., Лузина И.В., Континентальный верхний мезозой Прибайкалья и Забайкалья (стратиграфия, условия осадконакопления, корреляция) (Континентальный верхний мезозой Прибайкалья, стратиграфия Прибайкалья и Забайкалья) — Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии Наук, 2001.

    . Google Scholar

  • Шурыгин Б.Л. , Анкудимова Л.А. Новообразования Приангарской межгорной впадины // Геология и геофизика.Геофиз. 1981. 7. С. 50–55.

  • SPECTRAplus. Программный комплекс для рентгеновских спектрометров. Вер. 2.2.3.1, Карлсруэ, Bruker AXS GmbH, 2010.

  • Taylor, S.R. и McLennan, S.M., Континентальная кора: ее состав и эволюция . Блэквелл, 1988.

    Google Scholar

  • Тетяев М.М., Южная окраина Иркутского угленосного бассейна, в Тр. ЦНИГРИ (Учеб.Central Geol. Res. Inst. Цветные драгоценные металлы, 1934, т. 2.

    Google Scholar

  • Тимофеев П.П. Юрская угленосная формация Южной Сибири и условия формирования в Тр. Геол. Inst. АН СССР. Вып. 198 (Тр. Геол. Ин-та АН СССР). М .: Наука, 1970, т. 198.

    Google Scholar

  • Туркина О.М., Ножкин А.Д., Баянова Т.Б. Источники и условия образования раннепротерозойских гранитоидов юго-западной окраины Сибирского кратона, Петрология , 2006, т. 14. нет. 3. С. 262–283.

    Артикул Google Scholar

  • Туркина О.М. Этапы формирования раннедокембрийской коры Шарыжалгайского поднятия фундамента, юго-запад Сибирского кратона: синтез Sm – Nd и U – Pb данных // Петрология, , 2010, т. 7, с. 18, нет. 2. стр.158–167.

    Google Scholar

  • Угольная база России. Том III. Угольные бассейны и города Восточной Сибири, (Красноярский край, Канско-Ачинский бассейн; Республика Хакасия, Минусинский бассейн; Республика Тыва, Улугхемский бассейн и территория Ирландии). Угольная база России.III. Угольные бассейны и месторождения Восточной Сибири (Красноярский край, Канско-Ачинский бассейн, Республика Хакасия, Минусинский бассейн, Республика Тыва, Улугхемский бассейн и другие месторождения; Иркутская область, Иркутский бассейн и месторождения колы Забайкалья), Москва: ООО «Геоинформ-Центр», 2002.

  • Воронцов А.А. , Ярмолюк В.В. Полихронная рифтовая система Северной Монголии – Забайкалья (этап формирования, магматизм , источники расплавов, геодинамика) // Литосфера, , 2004, № 2, с.3. С. 17–32.

    Google Scholar

  • Юрские континентальные отложения юга Сибирской платформы (Юрские континентальные отложения юга Сибирской платформы) / Под ред. Одинцова М.М. М .: Недра, 1967.

  • Зоненшайн Л.П., Кузьмин М.И., Натапов Л.М., Тектоника литосферных плит территории СССР, , М .: Недра, 1990, Кн 2.

    Google Scholar

  • Зорин Ю.А. Геодинамика западной части Монголо-Охотского коллизионного пояса, Забайкальский регион (Россия) и Монголия // Тектонофизика, , 1999, т. 306. С. 33–56.

    Google Scholar

  • Джозеф А.Дада, Роуленд Э. К. Ворлу, Адевале О. Осибанджо, Даниэль Э. Уфуа, Хезекия О. Фалола

    Название / Автор (s )

    Страницы

    ВОСПРИЯТИЕ СТУДЕНТАМИ О ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, ОСНОВАННОЕ НА УЧАСТНИКАХ ДЛЯ ОБУЧЕНИЯ В УНИВЕРСИТЕТЕ

    Инмакулада Матеос-Апарисио, Марта Санчес-Паниагуа, Алехандра Гарсиа-Алонсо, Беатрис Лопес-Руис, Марина Молина, Мария Морено-Гусман, Мария Луиза Перес-Родригес, Хосе Руэдасио Сеаджио, Карменос-Паджио, Карменос-Сеаджио de la Peña-Armada

    9-14

    15-20

    21-26

    27-32

    33-38

    39-47

    48-54

    55-59

    60-68

    69-75

    76-80

    81-93

    94-102

    103-107

    108-117

    118-122

    123-134

    135-149

    150-155

    156-161

    162-169

    170-175

    176-181

    182-186

    187-196

    197-203

    204-206

    207-216

    217-225

    226-233

    234-242

    243-251

    252-262

    ЭТНОКУЛЬТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ФРАНЦУЗСКОГО РЕКЛАМНОГО ДИСКУРСА (НА ОСНОВЕ ФРАНЦУЗСКОЙ СОЦИАЛЬНОЙ РЕКЛАМЫ)

    Екатерина Д.Калинникова Владислав Евгеньевич Анисимов

    263-268

    269-273

    274-283

    284-293

    294-300

    301-306

    307-316

    317-326

    327-330

    331-334

    335-347

    348-351

    352-358

    359-367

    368-372

    373-377

    378-382

    383-387

    388-391

    392-395

    396-404

    405-413

    414-421

    422-428

    ФАКТОРЫ ВНЕШКОЛЬНОГО ОБУЧЕНИЯ, СПОСОБСТВУЮЩИЕ НАПРАВЛЕНИЮ УЧЕБНОЙ ДОСТИЖЕНИЯ УЯЗВИМЫХ УЧАЩИХСЯ В СТАРШИХ ШКОЛАХ ЛЕСОТО

    Мампака Анна Хлодженг и Альфред Генри Макура

    429-438

    439-444

    АКТ ИЗВИНЕНИЯ В ОБРАЗОВАНИИ СЕТСВАНЫ

    Бриджит Мангвегапе

    445-450

    ПОСЛЕДСТВИЯ ПРЕПЯТСТВИЙ / НАСИЛИЯ НА РАБОЧЕМ МЕСТЕ ДЛЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ СРЕДИ ЖЕНЩИН В СЕКТОРЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ ПАКИСТАНА: МОДЕРАЦИЯ ПРАВОВОЙ СРЕДЫ

    Абида Халик, Дато Шри, Ашгар Али Али Мохамед, Мухамад Хасан Ахмад

    451-464

    ПОЛУСТРУКТУРИРОВАННЫЙ ОНЛАЙН ПОДХОД К ПОМОЩИ СТУДЕНТАМ В БОЛЬШИНСТВЕ ПРОЕКТНОГО ОБУЧЕНИЯ (PBL)

    Марван Эльмубарак

    465-472

    ВОВЛЕЧЕНИЕ ВИДЕОРЕКЛАМАМИ В ЭРА COVID-19

    Sónia Ferreira, Pedro Espírito Santo, Сара Сантос

    473-480

    ИННОВАЦИОННЫЕ ПОДХОДЫ К ПЕДАГОГИЧЕСКОМУ КОНСУЛЬТИРОВАНИЮ СТУДЕНТОВ ВУЗОВ В ПАНДЕМИИ

    Сергей Ю.Лаврентьев, Крылов Дмитрий Анатольевич, Кондратенко Елена Валерьевна

    481-485

    ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ПЕДАГОГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ В ВЫСШЕЙ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ШКОЛЕ

    Власов Дмитрий, Синчуков Александр

    486-492

    ОПЕРАЦИОННАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ В ВЫСШЕМ ОБРАЗОВАНИИ В НИГЕРИИ: РАЗВИТИЕ МАСШТАБА: ПРИМЕР УНИВЕРСИТЕТА COVENANT, ОТА, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАТУС, НИГЕРИЯ

    КЕХИНДЕ, Бусола Э., OGUNNAIKE, Olaleke O., IBIDUNNI, Ayodotun S., ILOGHO, Simon O., ADEDUGBA, Adebayo T., KEHINDE, Segun I.

    493-499

    НАВЫКИ ИЗУЧЕНИЯ ЯЗЫКА, СВЯЗАННЫЕ С ПРОБЛЕМАМИ ОБУЧЕНИЯ ТУРЕЦКОМУ КАК ИНОСТРАННОМУ ЯЗЫКУ: НА СЛУЧАЕ ИНТЕНСИВНЫХ КУРСОВ ЯЗЫКОВ В УНИВЕРСИТЕТЕ ТЛЕМЦЕНА, АЛЖЕРИЯ

    Бухатем Надера

    500-503

    КОРЕННЫЕ ЗНАНИЯ КАК АЛЬТЕРНАТИВНАЯ ПЕДАГОГИКА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ СПОСОБНОСТИ УЧАСТИЯ В ПРЕПОДАВАНИИ И ИЗУЧЕНИИ МАТЕМАТИЧЕСКОЙ ГЕОМЕТРИИ В ТПО

    Махоси П.Мадимабе, Бунми И. Омодан, Чиас Т. Цотеци

    504-512

    ПЕРСПЕКТИВЫ ПОДГОТОВКИ СТУДЕНТОВ ТЕХНИЧЕСКИМ СПЕЦИАЛЬНОСТИ В ВУЗах РОССИИ

    Богдан Ершов, Светлана Соловьева, Елена Савицкайте, Анна Макарова

    513-516

    ОБРАЗОВАНИЕ В ВУЗЕ КАК ВАЖНЫЙ ФАКТОР СОЦИАЛИЗАЦИИ СТУДЕНТОВ В РОССИИ

    Богдан Ершов, Татьяна Жданова, Сергей Каширский, Татьяна Монко

    517-520

    ИСКУССТВЕННЫЙ ИНТЕЛЛЕКТ ДЛЯ ОБРАЗОВАНИЯ В СТАНОВЛЕНИИ ЦИФРОВОГО ОБЩЕСТВА: ВЫЗОВЫ И ВОЗМОЖНОСТИ

    Алексей Радугин, Лариса Перевозчикова, Евгения Авдеенко

    521-526

    ИНКЛЮЗИВНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ В ВЫСШЕМ ОБРАЗОВАНИИ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ

    Лариса Маслихова, Екатерина Волкова, Елена Фролова, Владимир Волокитин, Анастасия Волокитина

    527-530

    УДЕРЖИВАЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ ПОДДЕРЖКИ ВИРТУАЛЬНОГО ОБУЧЕНИЯ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ ЭМОЦИОНАЛЬНЫМ ИНТЕЛЛЕКОМ И ФАКУЛЬТЕТИЧЕСКИМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕМ В УЧРЕЖДЕНИЯХ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

    Фалола Х.О; Адениджи А.А., Осибанджо А.О., Салау О.П. и Огейунгбо О.О.

    531-535

    ОБУЧЕНИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЮ И ПЕРЕВОДУ НА НЕЯЗЫКОВЫХ ФАКУЛЬТАХ ВО ВРЕМЯ ПАНДЕМИИ 2020 ГОДА

    Ирина Мешкова, Ольга Шереметьева, Лариса Спыну

    536-541 542-549

    Ингибирование гистаминового рецептора 3 подавляет рост опухоли глиобластомы, инвазию и переход эпителия в мезенхиму

    ВВЕДЕНИЕ

    Диффузная инфильтрация опухолевых клеток в головном мозге является основным признаком астроцитом высокой степени злокачественности, особенно глиобластомы [1, 2]. Инвазивность опухоли приводит к серьезным структурным и функциональным повреждениям окружающей мозговой ткани, неполной хирургической резекции и высокой частоте рецидивов опухоли со средней продолжительностью жизни 12–14 месяцев [1, 2].Одним из важных факторов, способствующих инвазивности астроцитом высокой степени злокачественности, является переход клеток глиомы из эпителия в мезенхиму (EMT) [3]. EMT — сложный клеточный процесс, отражающий высокий уровень фенотипической пластичности, который характеризуется подавлением эпителиальных маркеров (E-кадгерин и ZO-1) и индукцией транскрипции мезенхимальных маркеров (виментин и N-кадгерин) [4]. . Переход эпителиальных клеток в мезенхимальные клетки вызывает потерю межклеточной адгезии, клеточной полярности и приобретение миграционных и инвазивных свойств [3].Поэтому понимание механизмов, которые управляют EMT, важно для определения новых целей для предотвращения метастазирования в астроцитоме.

    По сравнению с тремя другими подтипами гистаминовых рецепторов, гистаминовый рецептор 3 (h4R) в основном экспрессируется в нейронах, которые регулируют синтез и высвобождение гистамина и нейротрансмиттеров в качестве пресинаптических ауторецепторов и гетерорецепторов [5-8]. Хотя широко считается, что он специфичен для центральной нервной системы (ЦНС), h4R также экспрессируется при различных раковых заболеваниях, что предполагает возможную роль онкогенеза.Экспрессия h4R в карциномах молочной железы коррелирует с уровнями ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) и повышенным уровнем злокачественности [9]. Экспрессия h4R в образцах злокачественного рака надпочечников также повышена по сравнению с нормальными тканями [10]. Дополнительные исследования подтвердили, что повышенная экспрессия h4R коррелирует с прогрессированием опухоли. Активация h4R его агонистом вызывает пролиферацию и миграцию клеток карциномы поджелудочной железы PANC-1 и клеток карциномы молочной железы MDA-MB-231 [9, 11].Однако еще предстоит определить, экспрессируется ли h4R в астроцитомах и участвует ли h4R в регуляции инвазивности и индукции EMT в этих клетках.

    h4R функционирует как пресинаптический ауторецептор и гетерорецептор на многочисленных перекрестках нейротрансмиссии и регулирует высвобождение и синтез нейротрансмиттеров, таких как гистамин, ацетилхолин, дофамин, норэпинефрин и 5-гидрокситриптамин [5-8]. Широко доказано, что h4R участвует в ряде неврологических расстройств, таких как нарушения сна, болезнь Альцгеймера, шизофрения и эпилепсия [12, 13].Между тем, h4R имеет несколько изоформ и может нацеливаться на различные пути передачи сигналов в нервной системе. Например, активация h4R не только ингибирует путь аденилатциклазы (AC), но также приводит к фосфорилированию митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), кальмодулин-зависимой протеинкиназы II (CaMKII). и пути передачи сигналов фосфолипазы A2 (PLA2) [13–16]. Блокада h4R обеспечивает защиту при нескольких состояниях, таких как воспаление, нейротоксичность, вызванная N-метил-D-аспарагиновой кислотой (NMDA), вызванный ишемией окислительный стресс и аутофагия [17–20].Учитывая высокий уровень экспрессии h4R в головном мозге, его роль в прогрессировании опухоли, множественную передачу сигналов и общую церебральную защиту, мы предположили, что h4R может иметь потенциальную роль в регуляции инвазивности и EMT GBM.

    Чтобы проверить нашу гипотезу, настоящие исследования были разработаны для (1) изучения экспрессии h4R в тканях и клеточных линиях астроцитом человека с помощью иммуногистохимического анализа, КПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга; (2) ингибировать сверхэкспрессию h4R с помощью малой интерферирующей РНК (siRNA) или антагониста в клетках U87MG для оценки роли h4R в природе метастазов, активаторов и маркеров EMT в клетках U87MG; (3) исследовать сигнальные пути ниже h4R с помощью siRNA или селективного агониста / антагониста в клетках U87MG; (4) изучить эффекты нокдауна или блокады h4R на модели с ксенотрансплантатом.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Экспрессия h4R коррелирует со степенью патологии астроцитомы

    На сегодняшний день доказательства экспрессии h4R в глиоме отсутствуют, и было только одно исследование, в котором сообщалось, что h4R не экспрессируется в клетках U373MG [21]. Здесь были отобраны 40 пациентов из больницы Тангду с диагнозом астроцитома в период с 2008 по 2012 год, в том числе 20 случаев астроцитомы низкой степени (LGA: 10 случаев пилоцитарной астроцитомы (PA) и 10 случаев фибриллярной астроцитомы (FA)) и 20 случаев астроцитома высокой степени злокачественности (HGA: 10 случаев анапластической астроцитомы (AA) и 10 случаев GBM).Десять образцов здоровой нормальной ткани головного мозга (NB), полученных от пациентов, перенесших пункционную биопсию без злокачественных новообразований, служили контролем. Собирали образцы тканей и измеряли экспрессию h4R с использованием иммуногистохимии, ПЦР в реальном времени и методов вестерн-блоттинга.

    Рисунок 1A показывает, что положительная иммунореактивность h4R была обнаружена в основном в соме нейронов в тканях NB, но не в клетках глии. Напротив, экспрессия h4R была обнаружена в клетках глиомы тканей астроцитомы и была самой высокой в ​​ткани GBM.Анализ с использованием программного обеспечения Image-Pro показал, что процент площади экспрессии (PEA) и средняя плотность (MD) h4R были значительно выше в ткани астроцитомы, чем в тканях NB, и оба индекса были выше в HGA, чем в LGA. ( P <0,01). Кроме того, PEA и MD экспрессии белка h4R в ткани GBM были значительно выше, чем в тканях AA ( P <0,01). Эти результаты были подтверждены с использованием методов ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга (рисунки 1B и 1C).Мы обнаружили, что ткани LGA и HGA имели более высокие уровни экспрессии мРНК и белка h4R, чем ткани NB ( P <0,01). Кроме того, относительный уровень экспрессии мРНК h4R и белка в HGA был значительно выше, чем в LGA ( P <0,01). Экспрессия как мРНК, так и белка h4R в GBM также была значительно выше, чем в AA ( P <0,01).

    h4R регулирует пролиферацию клеток U87MG

    Уровни экспрессии h4R

    в нормальных человеческих астроцитах (hAstrocytes) и клеточных линиях глиомы (C6MG, IMR-32, U251MG, U87MG) измеряли с использованием методов кПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга.Результаты на Фигуре 2А показали, что линии клеток глиомы имели значительно более высокий уровень экспрессии мРНК h4R, чем hAstrocytes. Клетки U87MG имели самую высокую эндогенную экспрессию h4R из четырех протестированных линий клеток глиомы, поэтому они были отобраны для дальнейших экспериментов in vitro . Чтобы исследовать роль h4R в этих клетках, использовали siRNA, специфичную для h4R. Вестерн-блот-анализ лизатов клеток, инкубированных с миРНК h4R (рис. 2В), показал, что эффективность нокдауна h4R составляла приблизительно 63% в клетках U87MG (клетки sih4R U87MG) по сравнению с клетками отрицательного контроля миРНК U87MG (клетки siNC U87MG).Было обнаружено, что подавление экспрессии h4R снижает пролиферацию клеток в этих клетках, как показано на Фигуре 2В ( P <0,01).

    Рисунок 1: сверхэкспрессия h4R в клетках астроцитомы. A. Репрезентативные изображения иммуногистохимического мечения для экспрессии h4R в астроцитоме и NB (полоса = 100 мкм). Изображение сравнения в ВЫБРАННЫХ РАЗДЕЛАХ состоит из выбранных прямоугольников на верхней панели (полоса = 25 мкм). B и C. Результаты группы , показывающие экспрессию h4R по результатам RT-qPCR и вестерн-блоттинга.Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. ** P <0,01 по сравнению с NB; ## P <0,01 по сравнению с LGA; && P <0,01 по сравнению с AA; n = 10 для каждого сорта образцов ткани.

    Фиг. 2. Ингибирование экспрессии h4R siRNA или антагонистом снижает пролиферацию клеток U87MG. A. Результаты группы экспрессии h4R с помощью RT-qPCR и вестерн-блоттинга в клетках глиомы и астроцитах человека. Б. Влияние миРНК h4R на пролиферацию клеток U87MG. Специфическая миРНК для h4R значительно снижает экспрессию белка h4R в клетках U87MG и пролиферацию клеток в клетках U87MG. C. Эффекты агониста / антагониста h4R на пролиферацию клеток U87MG. Клетки U87MG инкубировали с агонистом / антагонистом h4R и измеряли пролиферацию клеток. Эффекты 100 нмоль / л RAMH на пролиферацию клеток U87MG полностью блокировались 100 нмоль / л CPX. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.** P <0,01 по сравнению с hAstrocyte; && P <0,01 по сравнению с SHAM; ## P <0,01 по сравнению с siNC; § P <0,05 против 0; §§ P <0,01 против 0; n = 8 для каждой группы.

    Для дальнейшего анализа роли h4R клетки U87MG, помещенные в 96-луночные планшеты (1,5 × 10 4 клеток / лунку), инкубировали с селективным агонистом h4R ( R ) — (α) — (-) — дигидробромид метилгистамина (RAMH) и / или его антагонист ципроксифан (CPX).Мы обнаружили, что предварительная обработка селективным агонистом h4R RAMH (10 -3 -10 мкмоль / л) способствовала пролиферации клеток U87MG дозозависимым образом. Напротив, блокирование активности h4R антагонистом CPX (10 -3 -10 мкмоль / л) подавляло пролиферацию клеток U87MG дозозависимым образом (рис. 2C). Клеточная пролиферация клеток U87MG после инкубации со 100 нмоль / л RAMH блокировалась 100 нмоль / л CPX. Исходя из этого, в последующих экспериментах использовали 100 нмоль / л RAMH и CPX.

    Ингибирование экспрессии h4R подавляет метастазирование в клетках U87MG

    Мы использовали анализ миграции заживления ран и инвазии через лунки, чтобы определить, может ли h4R влиять на метастазирование в клетках U87MG (рис. 3A). Мы обнаружили, что при подавлении экспрессии h4R с помощью siRNA миграция клеток U87MG в направлении искусственно созданных ран в монослоях конфлюэнтных клеток подавлялась, о чем свидетельствует уменьшение количества мигрирующих клеток ( P <0,01). Подавление экспрессии h4R также привело к тому, что меньшее количество клеток инфильтрировало мембраны в анализе трансвелл по сравнению с контролем ( P <0.01, рисунок 3В).

    Селективный агонист и антагонист h4R использовались параллельно в анализах заживления ран и трансвеллеров, чтобы подтвердить наши результаты, как показано на рисунке 3C. Мы обнаружили, что активация h4R с помощью RAMH вызывала значительное увеличение миграции по сравнению с контролем ( P <0,01), которая ингибировалась CPX. Кроме того, блокада h4R CPX привела к резкому снижению миграции ( P <0,01). Как и ожидалось, RAMH увеличил количество инфильтрирующих клеток U87MG в анализе через лунки ( P <0.01, рис. 3D), эффект, который подавлялся совместной инкубацией с CPX. Наконец, антагонист CPX уменьшал количество мигрирующих клеток ( P <0,01).

    Ингибирование экспрессии h4R подавляет ЕМТ в клетках U87MG

    Уровни мРНК активаторов ЕМТ улитки, слага и скручивания измеряли в клетках U87MG, лишенных h4R. Мы обнаружили, что все маркеры EMT были значительно подавлены по сравнению с контрольной группой ( P <0,01, рисунок 4A). Параллельно подавление h4R также привело к усилению регуляции эпителиальных маркеров E-кадгерина и ZO-1 и понижению регуляции мезенхимальных маркеров N-кадгерина и виментина ( P <0.01, рисунок 4В).

    Фиг. 3. Ингибирование h4R с помощью siRNA или CPX снижает метастатическую и инвазивную способность клеток U87MG. A и B. Группа является результатом анализа миграции заживления ран и анализа инвазии через лунки после подавления h4R с помощью siRNA. Подавление h4R с помощью siRNA ингибировало клеточную миграцию и инвазию клеток U87MG. C и D. Группа — результаты анализа миграции при заживлении ран и анализа инвазии через лунки после предварительной обработки агонистом h4R RAMH или / и антагонистом CPX.Блокада h4R антагонистом подавляла миграцию клеток и инвазию клеток U87MG. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. ** P <0,01 по сравнению с siNC; ## P <0,01 по сравнению с SHAM; n = 8 для каждой группы.

    Фиг. 4. Ингибирование h4R с помощью siRNA или CPX подавляло прогрессирование ЕМТ в клетках U87MG. A и B. Группа , полученная в результате RT-qPCR и вестерн-блоттинга после подавления экспрессии h4R с использованием siRNA. Подавление h4R с помощью siRNA снижает мРНК активаторов EMT, увеличивает эпителиальные маркеры (E-кадгерин и ZO-1) и снижает мезенхимальные маркеры (N-кадгерин и виментин) в клетках U87MG. C и D. Группа — результаты RT-qPCR и вестерн-блоттинга после предварительной обработки агонистом h4R RAMH или / и антагонистом CPX. Блокада h4R с помощью CPX снижает мРНК активаторов EMT, увеличивает эпителиальный маркер (E-кадгерин и ZO-1) и снижает мезенхимальный маркер (N-кадгерин и виментин) в клетках U87MG. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. ** P <0,01 по сравнению с siNC; # P <0,05 по сравнению с SHAM; ## P <0,01 по сравнению с SHAM; n = 8 для каждой группы.

    Инкубация с RAMH приводила к усиленной экспрессии мРНК slug, snail и twist в клетках U87MG ( P <0,01, фиг. 4C), и этот эффект блокировался CPX. Точно так же предварительная обработка CPX привела к подавлению уровней мРНК активаторов EMT ( P <0,01, фигура 4C). Анализы иммуноблоттинга подтвердили, что селективный агонист h4R RAMH значительно увеличивал экспрессию белков N-кадгерина и виментина при одновременном снижении E-кадгерина и ZO-1 в клетках U87MG ( P <0.01, рисунок 4D). Этот эффект был обращен селективным антагонистом h4R CPX. Кроме того, предварительная обработка CPX увеличивала экспрессию E-кадгерина и ZO-1 и подавляла N-кадгерин и виментин в клетках U87MG ( P <0,01, фигура 4D).

    h4R активирует EMT через пути передачи сигналов PI3K / Akt и MEK / ERK

    Сообщалось, что пути передачи сигналов Akt и ERK играют роль в модуляции клеточной инвазии и прогрессирования EMT. Здесь мы исследовали влияние h4R на эти два сигнальных пути.Мы обнаружили, что подавление h4R с помощью siRNA значительно снижает фосфорилирование PI3K, Akt, MEK и ERK, но не уровень их общего белка ( P <0,01, фиг. 5A). Точно так же обработка клеток h4R-селективным агонистом значительно увеличивала уровень фосфорилирования Akt, PI3K, ERK и MEK, тогда как CPX-антагонист h4R значительно подавлял фосфорилирование PI3K, Akt, MEK и ERK ( P <0,01). В обоих случаях уровни общего белка PI3K, Akt, MEK и ERK ( P <0.01, фиг. 5B) не подвергались влиянию, как это наблюдалось в необработанных клетках. Совместная инкубация со 100 нмоль / л CPX подавляла 100 нмоль / л RAMH-индуцированное фосфорилирование PI3K, Akt, MEK и ERK. Кроме того, предварительная обработка 100 нг / мл коклюшного токсина (PTX) полностью предотвращала активацию, наблюдаемую после лечения RAMH ( P <0,01). Эти наблюдения показали, что опосредованная h4R активация сигнальных путей PI3K / Akt и MEK / ERK в клетках U87MG зависит от PTX-чувствительных белков G i / o .

    Чтобы проверить роль сигнальных путей PI3K / Akt и MEK / ERK в клеточной инвазии, связанной с h4R, и прогрессировании ЕМТ, были использованы миРНК для Akt2 или ERK1, и было обнаружено, что эффективность нокдауна для Akt и ERK составила 53% и 51% соответственно в клетках U87MG ( P <0,01, рис. 5C). Подавление Akt или ERK значительно ослабляло эффекты RAMH на уровни белка E-кадгерина и виментина по сравнению с отрицательным контролем ( P <0,01, фиг. 5D).Результаты анализа через лунки показали, что нокдаун Akt или ERK подавлял опосредованное RAMH увеличение количества инфильтрирующих клеток ( P <0,01, фиг. 5D). Было обнаружено, что антагонисты для сигнальных путей PI3K / Akt и MEK / ERK, LY294002 и U-0126, также подавляют вызванное RAMH увеличение миграции клеток U87MG ( P <0,01, фигура 5D). Соответственно, LY294002 и U-0126 подавляли RAMH-индуцированную повышающую регуляцию N-кадгерина и понижающую регуляцию E-кадгерина ( P <0.01, рисунок 5D).

    Ингибирование h4R ингибирует рост опухоли

    in vivo

    Чтобы оценить эффект ингибирования h4R in vivo , мы создали модель подкожного ксенотрансплантата на голых мышах. Крыс случайным образом распределяли в одну из следующих четырех групп: (1) группа siNC: голым крысам инокулировали клетки U87MG с имитационной трансфекцией в течение 4 недель; (2) группа sih4R: голым крысам инокулировали клетки U87MG, трансфицированные миРНК h4R, в течение 4 недель; (3) Группа носителя: голых крыс инокулировали клетками U87MG.Когда подкожные опухоли достигли 50 мм 3 (около 2 недель), голые крысы получили I.V. инъекции носителя (0,9% NaCl) один раз в день в течение 4 нед; (4) Группа CPX: голых крыс инокулировали клетками U87MG. Когда подкожные опухоли достигли 50 мм 3 (около 2 недель), голые крысы получили I.V. инъекции CPX (3 мг / кг) 1 раз в сутки в течение 4 нед. Через 4 нед объем опухоли в группе siNC выше, чем в группе sih4R ( P <0,01, фигура 6A). Последовательное абдоминальное введение CPX в дозе 3 мг / кг в течение 4 недель также вызывало ограниченную задержку роста опухоли в группе CPX по сравнению с группой носителя ( P <0.01, рисунок 6А). Кроме того, иммуногистохимические исследования срезов опухолей показали, что экспрессия E-кадгерина была значительно увеличена, а N-кадгерин снижен в группе sih4R и группах CPX по сравнению с группой siNC и группами носителя (фигура 6B). Данные вестерн-блоттинга опухолей в группах sih4R и CPX также показали, что уровни белка E-кадгерина значительно увеличились, в то время как маркер мезенхимального фенотипа N-кадгерин снизился по сравнению с группами siNC и носителем ( P <0.01, рисунок 6C).

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Об экспрессии h4R сообщалось в нейронах [22-25]. Более поздние исследования сообщили об экспрессии h4R в культивируемых астроцитах крыс из коры, мозжечка, гиппокампа и полосатого тела [26]. В соответствии с этими исследованиями, наши результаты показали, что высокие уровни экспрессии h4R характерны для нейронов, а более низкие уровни обнаруживаются в глиальных клетках ткани NB и культивируемых астроцитах. Напротив, интенсивное окрашивание h4R наблюдалось в клетках глиомы человека ткани астроцитомы, особенно в GBM.Несмотря на то, что экспрессия h4R не была задокументирована для клеток U373MG [21], исследование клеточных линий глиомы (C6MG, IMR-32MG, U251MG, U87MG) выявило относительно высокий уровень как мРНК h4R, так и белка по сравнению с hAstrocytes. Эта атипичная повышающая регуляция h4R в клетках глиомы может быть проявлением паттерна дифференцировки нейронов в опухолях глиомы. Дальнейший анализ h4R показал, что HGA имеет повышенную экспрессию мРНК и белка, увеличение PEA и MD h4R, чем LGA. Следовательно, экспрессия h4R коррелирует со степенью патологии, и h4R может быть фактором прогноза при астроцитоме.

    Фиг. 5: Ингибирование Akt / ERK с помощью siRNA или CPX подавляет RAMH-индуцированную клеточную инвазию или реорганизацию кадгеринового домохозяйства. A и B. Репрезентативные иммуноблоты образцов лизатов клеток U87MG, подвергнутых различным обработкам, и их количественный денситометрический анализ. Ингибирование h4R с помощью siRNA или CPX подавляло активацию сигнальных путей PI3K / Akt и MEK / ERK. C и D. Группа результатов вестерн-блоттинга после применения siRNA Akt2 / ERK1 и антагонистов.Применение миРНК Akt2 / ERK1 значительно ингибировало экспрессию Akt / ERK в клетках U87MG. Ингибирование Akt / ERK siRNA или антагонистом подавляло RAMH-индуцированную клеточную инвазию и реорганизацию кадгеринового домохозяйства; Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. ** P <0,01 по сравнению с siNC; # P <0,01 по сравнению с SHAM; ## P <0,01 по сравнению с SHAM; && P <0,01 по сравнению с RAMH; n = 8 для каждой группы.

    Рисунок 6: Ингибирование h4R с помощью siRNA или CPX сдерживает рост и прогрессирование EMT в модели с ксенотрансплантатом. A. Групповые репрезентативные изображения опухолей ксенотрансплантата и количественный анализ объема опухоли после лечения; B. Групповые репрезентативные изображения иммуногистохимического мечения маркеров эпителиального и мезенхимального фенотипа в собранных опухолевых тканях (полоса = 100 мкм). C. Вестерн-блоттинг для экспрессии маркеров эпителиального и мезенхимального фенотипа в собранных опухолевых тканях и их количественный денситометрический анализ. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.** P <0,01 по сравнению с siNC; ## P <0,01 по сравнению с SHAM; n = 8 для каждой группы.

    Повышенная экспрессия h4R в GBM по сравнению с другими классами астроцитом предполагает возможную роль GBM в опухолевой прогрессии. Чтобы исследовать роль h4R в прогрессировании опухоли, мы использовали CPX-антагонист h4R и специфическую миРНК для h4R in vitro и in vivo для подавления активности или экспрессии белка.По сравнению с другими антагонистами h4R, CPX проявлял неинтерактивное антагонистическое действие с другими рецепторами гистамина, а блокада h4R с помощью CPX показала защиту в ряде патологических состояний, таких как шизофрения, болезнь Альцгеймера и нарушения сна [27–29]. Мы обнаружили, что ингибирование h4R с помощью CPX или siRNA в клетках U87MG значительно ингибировало пролиферацию клеток in vitro и in vivo , что согласуется с предыдущими исследованиями с использованием гистаминовых рецепторов 1 и 2 в астроцитоме [21, 30].Интересно, что предыдущее исследование показало, что эффект h4R на пролиферацию опухолей зависит от опухоли. Например, активация h4R агонистами индуцировала пролиферацию клеток карциномы поджелудочной железы PANC-1 и клеток карциномы молочной железы MDA-MB-231 [9, 11], тогда как активация h4R агонистом подавляла пролиферацию клеток гепатомы McA-RH7777 и клетки холангиокарциномы Mz-ChA-1 [31, 32]. Факторы, которые определяли, является ли h4R стимулирующим или ингибирующим рецептором на пролиферацию опухоли, были сложными, включая характеристики опухолей, изоформы h4R и сложность задействованных путей передачи сигнала.Во-первых, активация h4R экзогенным гистамином подавляла пролиферацию клеток гепатомы McA-RH7777 [31], тогда как блокада h4R способствовала пролиферации из-за нежелательного высвобождения ферментов цитохрома P450 в клетках McA-RH7777, которые регулируют пролиферацию клеток, контролируя уровни факторов регуляции роста [12]. Во-вторых, было документально подтверждено, что изоформы h4R соединяются с различными G-белками, чтобы разнообразить свои сигнальные эффекты в различных клеточных системах [14, 33]. В частности, стимуляция h4R с помощью RAMH (действующая через Gα i ) ингибировала гиперпластический рост желчных путей посредством ингибирования цАМФ [34], в то время как RAMH (действуя через Gα o ) уменьшала рост клеток холангиокарциномы Mz-ChA-1 под действием инозитолтрифосфата (IP 3 ) / Ca 2+ , который не зависит от активации цАМФ [32].В-третьих, активация h4R не только ингибирует аденилатциклаза-зависимый путь цАМФ, но также активирует сигнальные пути MAPK, PI3K, CaMKII и PLA [13–16]. В разных опухолях основные пути передачи сигналов, опосредованные h4R, могут быть разными, и h4R может способствовать противоположному действию на одну передачу сигналов в разных опухолях. Например, активация h4R с помощью RAMH способствовала передаче сигналов MAPK в гиперпластических желчных путях [34], тогда как активация h4R подавляла передачу сигналов MAPK в клетках Mz-ChA-1 холангиокарциномы [32].Взятые вместе, окончательный эффект активации h4R на пролиферацию опухоли требует повторного тестирования для проверки. Наши результаты не выявили противоречий с существующими знаниями.

    Несмотря на то, что роль h4R в пролиферации опухолей широко задокументирована, оставалось определить, участвует ли h4R в регуляции инвазии. Здесь мы впервые показали, что ингибирование h4R подавляет миграцию и инвазию клеток глиомы in vitro , тогда как активация h4R агонистом имела противоположный эффект.Исследования GBM показали, что EMT (-подобные) процессы имеют клиническое значение при злокачественных опухолях головного мозга [35–37], которые включают реорганизацию кадгеринового домохозяйства (переключение с E-кадгерина на N-кадгерин) с целью разрушения межклеточного взаимодействия. клеточные контакты [38, 39]. Члены семейства Twist-, Slug- и Snail опосредуют повышенную подвижность и инвазивность GBM-клеток как in vitro, , так и in vivo , как показано в исследованиях на животных и в образцах, полученных от пациентов [40–42]. В наших исследованиях мы обнаружили, что нокдаун экспрессии h4R подавлял экспрессию активаторов ЕМТ (Twist, Slug и Snail) и восстанавливал экспрессию маркеров эпителиальных клеток (E-кадгерина и ZO-1), в то время как блокада его активности подавляла регуляцию экспрессия маркеров мезенхимальных клеток (N-кадгерина и виментина) в клетках глиомы U87MG.В совокупности ингибирование экспрессии или активности h4R в клетках глиомы подавляло инвазию опухоли и обращало EMT, предполагая, что нацеливание передачи сигналов h4R в GBM может быть многообещающей противораковой стратегией.

    Возможное объяснение различного поведения опухолей при GBM — нарушение регуляции путей передачи сигналов, таких как пути PI3K / Akt и MEK / ERK, вызванное большим количеством генетических аномалий [43]. Большое количество нижестоящих молекул и перекрестные помехи этих двух сигнальных путей оказывают широкий спектр влияний на GBM [43].Предыдущие исследования показали, что пути PI3K / Akt и MEK / ERK постоянно активируются в большинстве GBM, что помогает неограниченному росту клеток глиомы и усиливает инвазию опухоли [44–47]. Более того, активация этих путей играет роль в прогрессировании ЭМП [48, 49]. Здесь мы сообщаем, что при подавлении экспрессии или активности h4R, активация сигнальных путей PI3K / Akt и MEK / ERK была подавлена, в то время как активация h4R с помощью RAMH индуцировала активацию обоих сигнальных путей в PTX-чувствительном G i / o . белковый образ.Чтобы дополнительно продемонстрировать роль вышеуказанных сигнальных путей в инвазии клеток, связанных с h4R, и прогрессе ЕМТ, мы применили селективный антагонист или подавили экспрессию сигнальных компонентов путей PI3K / Akt и MEK / ERK. Либо нокдаун, либо блокада сигнальных путей PI3K / Akt или MEK / ERK ингибировали RAMH-опосредованное увеличение клеточной инвазии и реорганизацию кадгеринового домохозяйства, подтверждая, что сигнальные пути PI3K / Akt и MEK / ERK играют роль в опосредованном h4R инвазия опухоли и прогрессирование ЭМП.

    Поскольку гистаминовые и гистаминовые рецепторы были открыты, доказано их роль в онкологии, включая астроцитому. Было высказано предположение, что существует множество и контекстно-зависимых эффектов h4R на пролиферацию в опухолях. Однако прямых доказательств экспрессии h4R в глиоме или понимания его участия в опухолевой инвазии и прогрессе EMT не хватало. Здесь мы обнаружили, что h4R был сверхэкспрессирован в клетках и тканях глиомы, а ингибирование h4R подавляло инвазию и EMT в глиобластоме посредством сигнальных путей PI3K / Akt и MEK / ERK.Биологические функции h4R, обнаруженные в этом исследовании, послужили основой для дополнительных патологических и клинических исследований, предполагающих, что h4R может быть новой мишенью для терапевтического вмешательства в GBM.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Образцы пациентов

    Протокол этого исследования был одобрен этическим комитетом Четвертого военно-медицинского университета. Для исследования были отобраны 40 пациентов из больницы Тангду с диагнозом астроцитома в период с 2008 по 2012 год.Все пациенты, участвовавшие в исследовании, дали согласие. Также были исключены пациенты с другими заболеваниями или те, кто проходил лечение до операции. Были проанализированы патологические образцы и составлена ​​гистологическая классификация астроцитом на основе классификации опухолей головного мозга Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [50]. Мы выявили 20 случаев LGA (10 случаев PA и 10 случаев FA) и 20 случаев HGA (10 случаев AA и 10 случаев GBM). Десять здоровых NB, полученных от пациентов, перенесших пункционную биопсию без злокачественных новообразований, служили контролем.Все слайды были повторно исследованы двумя патологами для подтверждения правильного диагноза. Образцы тканей собирали для иммуногистохимического анализа, ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга.

    Клеточные линии

    Клеточные линии глиомы человека, клетки C6MG, IMR-32, U87MG и U251MG были приобретены из Американской коллекции типовых культур (Роквилл) и банка клеток Китайской академии наук. Клетки культивировали с использованием среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков пенициллина-стрептомицина.Нормальные человеческие астроциты (hAstrocytes) были получены от ScienCell и размножены в среде астроцитов (ScienCell).

    Малые интерферирующие РНК (миРНК)

    Клетки U87MG, растущие в 6-луночных планшетах, инкубировали с человеческими миРНК (100 нмоль / л) для h4R / Akt2 / ERK1. Мок-трансфекцию выполняли с использованием миРНК отрицательного контроля (Santa Cruz Biotechnology) в качестве контроля. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции, промывали и хранили для будущих экспериментов. Эффективность нокдауна оценивали с помощью вестерн-блоттинга.

    Анализ пролиферации клеток

    Клетки высевали в 96-луночные планшеты (1,5 × 10 4 клеток / лунку) на 24 часа. В это время в каждую лунку добавляли 10 мкл реагента CCK-8 (Dojindo), а затем планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 90 мин. Поглощение измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Bio-Rad).

    Анализ миграции при заживлении ран

    Клетки sih4R U87MG и клетки siNC U87MG высевали в 6-луночные чашки и культивировали в условиях голодания в течение ночи, пока они не достигли слияния 80–90%.Стерильный наконечник пипетки объемом один миллилитр использовали для создания раны на клеточном монослое, и остатки промывали PBS. Параллельно клетки U87MG обрабатывали агонистом / антагонистом h4R. Через 48 ч клетки, мигрирующие в область раны или выступающие из границы раны, были визуализированы, сфотографированы и подсчитаны под инвертированным микроскопом. В общей сложности девять областей были выбраны случайным образом в каждой лунке с использованием 100-кратного увеличения, и клетки в трех лунках каждой группы были подсчитаны для каждого эксперимента.Эксперименты проводили в трех экземплярах как минимум трижды.

    Анализ инвазии

    Верхняя камера 24-луночного вкладыша с подвешенной культурой клеток была предварительно покрыта 24 мкг / мкл матригеля (BD Biosciences). 5 × 10 5 клеток U87MG ресуспендировали в 200 мкл бессывороточной среды и высевали в верхнюю камеру 24-луночного вкладыша для подвешенных культур клеток (Millipore), снабженного полиэтилентерефталатом (размер пор 8,0 мм). Затем агонисты / антагонисты для h4R, PI3K, MEK или белка G i / o (все от Santa Cruz Biotechnology) добавляли в верхнюю камеру следующим образом (100 мкмоль / л LY294002 для PI3K; 10 мкмоль / л U- 0126 для MEK; 100 нг / мл PTX для белка G i / o ) и 900 мкл среды DMEM с 20% FBS добавляли в нижнюю камеру каждой лунки.Через 48 ч клетки фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Клетки на верхней поверхности вставки удаляли ватным тампоном. Клетки, прилипшие к нижней поверхности, фиксировали метанолом, окрашивали раствором Гимзы и подсчитывали под микроскопом в пяти заранее определенных полях (200 ×).

    Установление опухоли ксенотрансплантатом

    Все процедуры на животных выполнялись в соответствии с Национальными руководящими принципами проведения экспериментов на животных и были одобрены этическим комитетом Четвертого военного медицинского университета.Всех мышей выращивали в асептических условиях при постоянной влажности и температуре со стандартными 12-часовыми циклами свет-темнота и свободным доступом к питьевой воде и стандартному корму. Клетки U87MG (1 × 10 7 в 100 мл физиологического раствора) суспендировали в объеме 0,2 мл бессывороточной среды и вводили подкожно в задние бока животных. В конце лечения голых крыс умерщвляли и рассчитывали объемы опухоли (0,5 × длина (мм) × ширина 2 ( 2 мм).Опухоли собирали, фиксировали в формалине и заливали парафином.

    Иммуногистохимический анализ

    Патологические образцы были быстро удалены, зафиксированы в течение ночи при 4 ° C, обезвожены в сахарозе градации и обработаны для заливки в парафин с сохранением анатомической ориентации. Срезы толщиной 3–4 мкм помещали на покрытые силаном предметные стекла и сушили на воздухе. Перед иммуногистохимическим окрашиванием срезы помещали в купальный раствор, содержащий 3% H 2 O 2 и 60% метанол PBS (pH 7.4) в течение 30 минут, а затем обрабатывали 0,01 моль / л натрийцитратного буфера при 95 ° C в микроволновой печи в течение 13 минут (извлечение антигена). Образцы блокировали с использованием 5% нормальной козьей сыворотки и 5% бычьего сывороточного альбумина в PBS. Перед каждым шагом срезы промывали три раза в буфере PBS. Инкубацию с первичными антителами к h4R (1: 100, Abcam) проводили в растворе 1% бычьего сывороточного альбумина на основе PBS в течение 12 ч при 4 ° C в рекомендуемых разведениях. После промывки PBS срезы инкубировали с соответствующими вторичными биотинилированными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре.Затем комплекс стрептавидин / пероксидаза хрена применяли в качестве системы обнаружения в течение 1 часа (1: 100; Abcam). Наконец, окрашивание проявляли с использованием 3,3’диаминобензидинтетрагидрохлорида в 0,05 моль / л трис-HCl буфера и 0,1% H 2 O 2 . Срезы отрицательного контроля инкубировали без первичного антитела.

    Анализ изображений

    Анализ изображений выполнялся с использованием микроскопа DMR-X, соединенного с цифровой камерой DC500 (Leica) и системой анализа изображений Quantimet Q550 (Leica).Были оценены девять случайно выбранных прерывистых полей (20 ×) для каждого образца. Положительную площадь, общую площадь и интегральную оптическую плотность h4R окрашивали и количественно оценивали с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus (Media Cybernetics). PEA измеряли как положительная площадь / общая площадь × 100%. MD выражения h4R в выбранных прерывистых полях измеряли как интегральную оптическую плотность / общую площадь × 1000. Среднее значение PEA и MD из указанных выше девяти полей было рассчитано от имени образца для дальнейшего анализа данных.

    ПЦР-анализ в реальном времени

    Образцы тканей и клетки помещали в жидкий азот на 10 мин, а затем в морозильную камеру при 80 ° C. Тотальную РНК экстрагировали из клеточных линий глиомы и образцов тканей с использованием реагента Trizol в соответствии с инструкциями производителя (Takara). РНК транскрибировали в кДНК с использованием набора реагентов PrimeScript RT (Takara). Для анализа экспрессии h4R продукты разделяли электрофорезом на 1,5% (об. / Об.) Агарозных гелях, окрашивали бромидом этидия и визуализировали в УФ-свете.QRT-PCR для других исследованных генов выполняли с использованием системы реального времени CFX96TM (Bio-Rad), и относительную экспрессию гена нормализовали по β-актину внутреннего контроля. Использовались следующие праймеры: h4R: прямой: 5′-TCATCGTGAGCATCTTTGGG-3 ‘, обратный: 5′-ACAGAGGGTAGAGG ACAGGGTT-3′; Улитка: Вперед: 5’-TTTACCTTCCAGCAGCCCTA-3 ‘, Обратный: 5′-GACAGAGTCCCAGATGAGCA-3′; Слаг: Вперед: 5’-ACAGCGAACTGGAC ACACAT-3 ‘, Обратный: 5′-GGAATGGAGCAGCGGTAGT-3’; Поворот: Вперед: 5′-CACCATCCTCACACCTCTGC-3 ′, Назад: 5′-GCTGATTGGCACGACCTCT-3 ′.

    Вестерн-блоттинг

    Белки экстрагировали из образцов тканей или клеток. Концентрацию общего белка определяли с использованием набора бицинхониновой кислоты (BCA) для определения белка (Takara). Образцы растворяли в 10% гелях SDS-PAGE и переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF). Иммуноблоты зондировали первичными антителами в течение ночи при 4 ° C. Были использованы следующие антитела от Abcam: h4R (1: 1000), E-кадгерин (1: 10000), N-кадгерин (1: 5000), ZO-1 (1:50), виментин (1: 1000), фосфо -PI3K (Tyr607) (1: 500).Следующие антитела были получены от Cell Signaling: фосфо-Akt (Ser473) (1: 1000), Akt (1: 1000), фосфо-ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204) (1: 1000), ERK1 / 2 (1: 1000). ), фосфо-MEK1 / 2 (Ser217 / Ser221) (1: 1000), MEK1 / 2 (1: 1000), PI3K (1: 1000) и β-актин (1: 1000). Все первичные антитела использовали в соответствии с инструкциями поставщика. После этого мембрану инкубировали с соответствующим HRP-связанным антителом против кроличьего IgG (1: 2000, передача сигналов от клеток) при комнатной температуре в течение 1 часа. Блоты визуализировали с помощью реагента ECL-Plus (Millipore).

    Статистический анализ

    Программное обеспечение SPSS 16.0 (SPSS Inc) и Graph Pad Prism 5.0 (программное обеспечение Graph Pad) использовали для анализа данных, и все значения были выражены как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ выполняли с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим множественным сравнительным тестом Бонферрони, где это необходимо. Тест Манна-Уитни U использовался для данных с неоднородностью дисперсии. Значение P <0,05 считалось значимым.

    БЛАГОДАРНОСТИ

    Работа поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№ 31270952, 81102217).

    ССЫЛКИ

    1. Xie Q, Mittal S, Berens ME. Ориентация на адаптивную глиобластому: обзор распространения и инвазии. Neuro Oncol. 2014; 16: 1575–1584.

    2. Вехлов А., Кордес Н. Инвазия как мишень для терапии мультиформной глиобластомы. Biochim Biophys Acta. 2013; 1836: 236–244.

    3. Калерт У. Д., Никкх Г., Мациачик Дж.Эпителиально-мезенхимальный (-подобный) переход как важное молекулярное событие при злокачественных глиомах. Cancer Lett. 2013; 331: 131–138.

    4. Линь Ю.К., Линь Дж. К., Хунг С.М., Чен Й., Лю Л.К., Чанг Т.К., Као Дж.Й., Хо К.Т., Уэй ТД. Osthole ингибирует индуцированный инсулиноподобным фактором роста-1 переход эпителия в мезенхиму посредством ингибирования сигнального пути PI3K / Akt в раковых клетках мозга человека. J. Agric Food Chem. 2014; 62: 5061–5071.

    5. Блайя Б., Николау-Гальмес Ф., Джанги С.М., Ортега-Мартинес I, Алонсо-Техерина Э., Бургос-Бретонес Дж., Перес-Ярза Г., Асуменди А., Бояно, доктор медицинских наук.Антагонисты гистаминовых и гистаминовых рецепторов в биологии рака. Цели лекарств от аллергии на воспаление. 2010; 9: 146–157.

    6. Шликер Э., Финк К., Хинтертанер М., Готерт М. Ингибирование высвобождения норадреналина в коре головного мозга крысы через пресинаптические рецепторы h4. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1989; 340: 633–638.

    7. Шликер Э., Финк К., Детцнер М., Готерт М. Гистамин подавляет высвобождение дофамина в полосатом теле мыши через пресинаптические рецепторы h4. J Neural Transm Gen Sect. 1993; 93: 1–10.

    8. Шликер Э., Бец Р., Готерт М. Опосредованное гистаминовым рецептором h4 ингибирование высвобождения серотонина в коре головного мозга крыс. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1988; 337: 588–590.

    9. Медина В., Кроци М., Кресченти Э., Мохамад Н., Санчес-Хименес Ф., Массари Н., Нуньес М., Крикко Г., Мартин Г., Бергок Р., Ривера Е. Роль гистамина в канцерогенезе молочной железы человека: h4 и рецепторы h5 как потенциальные терапевтические мишени для лечения рака груди. Cancer Biol Ther. 2008; 7: 2835.

    10. Szabo PM, Wiener Z, Tombol Z, Kovacs A, Pocza P, Horanyi J, Kulka J, Riesz P, Toth M, Patocs A, Gaillard RC, Falus A, Racz K, Igaz P. Различия в выражениях генов и белков, связанных с гистамином, в нормальной коре надпочечников и опухолях надпочечников человека. Арка Вирхова. 2009; 455: 133–142.

    11. Крико Г.П., Мохамад Н.А., Самбуко Л.А., Жанр F, Крочи М., Гутьеррес А.С., Медина В.А., Бергок Р.М., Ривера Е.С., Мартин Г.А. Гистамин регулирует рост клеток карциномы поджелудочной железы через рецепторы h4 и h5.Inflamm Res. 2008; 57: S23–24.

    12. Бховмик М., Ханам Р., Вохора Д. Антагонисты гистаминовых рецепторов h4 в отношении эпилепсии и нейродегенерации: системное рассмотрение последних достижений и перспектив. Br J Pharmacol. 2012; 167: 1398–1414.

    13. Вохора Д., Бхоумик М. Антагонисты / обратные агонисты рецепторов гистамина h4 на когнитивные и моторные процессы: актуальность для болезни Альцгеймера, СДВГ, шизофрении и злоупотребления наркотиками. Front Syst Neurosci. 2012; 6:72.

    14.Леви Р., Сейеди Н., Шефер У., Эстефан Р., Маккинс Си Джей, Тайлер Э., Сильвер РБ. Передача сигналов гистаминового рецептора h4 в сердечных симпатических нервах: идентификация нового пути MAPK-PLA2-COX-PGE2-EP3R. Biochem Pharmacol. 2007; 73: 1146–1156.

    15. Морено Е., Хоффманн Х., Гонсалес-Сепульведа М., Наварро Дж., Касадо В., Кортес А., Маллол Дж., Виньес М., Маккормик П.Дж., Канела Е.И., Луис С., Мораталла Р., Ферре С., Ортис Дж., Франко Р. Гетеромеры дофаминового рецептора D1-гистамина h4 обеспечивают селективную связь с передачей сигналов MAPK в ГАМКергических нейронах прямого пути полосатого тела.J Biol Chem. 2011; 286: 5846–5854.

    16. Bongers G, Sallmen T, Passani MB, Mariottini C, Wendelin D, Lozada A, Marle Av, Navis M, Blandina P, Bakker RA, Panula P, Leurs R. Ось Akt / GSK-3β как новая сигнальный путь гистаминового рецептора h4. J Neurochem. 2007; 103: 248–258.

    17. Ахтар М., Пиллай К., Вохора Д. Влияние тиоперамида на маркеры окислительного стресса в модели фокальной церебральной ишемии у крыс с окклюзией средней мозговой артерии. Hum Exp Toxicol. 2008; 27: 761–767.

    18. Dai H, Fu Q, Shen Y, Hu W, Zhang Z, Timmerman H, Leurs R., Chen Z. Клобенпропит, антагонист гистаминовых рецепторов h4, усиливает высвобождение ГАМК для защиты от индуцированной NMDA эксайтотоксичности через цАМФ / протеинкиназу Путь в культивируемых корковых нейронах. Eur J Pharmacol. 2007; 563: 117–123.

    19. Янь Х, Чжан Х, Ху В., Ма Дж, Хоу В., Чжан Х, Ван Х, Гао Дж, Шен Й, Ур Дж, Оцу Х, Хань Ф, Ван Г, Чен З. Обостряются гистаминовые рецепторы h4. ишемическое повреждение головного мозга по гистамин-независимым механизмам.Nat Commun. 2014; 25: 3334.

    20. Zhang DD, Sisignano M, Schuh CD, Sander K, Stark H, Scholich K. Передозировка питолизанта, обратного агониста гистамина H (3), увеличивает пороги тепловой боли. Inflamm Res. 2012; 61: 1283–1291.

    21. Эрнандес-Анхелес А, Сориа-Хассо ЛЕ, Ортега А, Ариас-Монтано Дж. Активация гистаминового рецептора h2 стимулирует митогенез в клетках MG астроцитомы человека U373. J Neurooncol. 2001; 55: 81–89.

    22. Coge F, Guenin SP, Audinot V, Renouard-Try A, Beauverger P, Macia C, Ouvry C, Nagel N, Rique H, Boutin JA, Galizzi JP.Геномная организация и характеристика вариантов сплайсинга человеческого гистаминового рецептора h4. Biochem J. 2001; 355: 279–288.

    23. Лёрс Р., Баккер Р.А., Тиммерман Х., де Эш И.Дж. Рецептор гистамина h4: от клонирования гена до препаратов рецептора h4. Nat Rev Drug Discov. 2005; 4: 107–120.

    24. Баккер Р.А. Изоформы гистаминовых h4-рецепторов. Inflamm Res. 2004; 53: 509–516.

    25. Бонгерс Г., Баккер Р.А., Лерс Р. Молекулярные аспекты гистаминового рецептора h4. Biochem Pharmacol.2007; 73: 1195–1204.

    26. Меле Т., Юрич Д.М. Идентификация и фармакологическая характеристика рецептора гистамина H в культивируемых астроцитах крыс. Eur J Pharmacol. 2013. DOI: 10.1016 / j.ejphar. 2013.

    27. Motawaj M, Arrang JM. Ципроксифан, антагонист / обратный агонист гистаминовых H (3) -рецепторов, модулирует индуцированную метамфетамином сенсибилизацию у мышей. Европейский J Neurosci. 2011; 33: 1197–1204.

    28. Барджетт М.Э., Дэвис Н.Н., Шультейс П.Дж., Гриффит М.С. Ципроксифан, антагонист рецептора h4, снижает гиперактивность и когнитивные нарушения на мышиной модели болезни Альцгеймера APP Tg2576.Neurobiol Learn Mem. 2011; 95: 64–72.

    29. Chauveau F, Laudereau K, Libourel PA, Gervasoni D, Thomasson J, Poly B, Pierard C, Beracochea D. Ципроксифан улучшает рабочую память за счет увеличения нейронной активности префронтальной коры у мышей с ограниченным сном. Нейрофармакология. 2014; 85: 349–356.

    30. Панула П., Линтунен М., Карлштедт К. Гистамин в развитии мозга и опухолях. Semin Cancer Biol. 2000; 10: 1114.

    31. Давенас Э, Руло А, Мориссет С., Аранг Дж. М.. Ауторегуляция пролиферации клеток гепатомы McA-RH7777 гистаминовыми рецепторами h4.J Pharmacol Exp Ther. 2008; 326: 406–413.

    32. Фрэнсис Х., Онори П., Гаудио Э., Франчитто А., Деморроу С., Вентер Дж., Коприва С., Карпино Г., Манчинелли Р., Уайт М., Мэн Ф., Ветуши А., Сферра Р., Альпини Г. Гистаминовый рецептор h4- Опосредованная активация протеинкиназы Cα ингибирует рост холангиокарциномы In vitro и In vivo . Mol Cancer Res. 2009; 7: 1704–1713.

    33. Drutel G, Peitsaro N, Karlstedt K, Wieland K, Smit MJ, Timmerman H, Panula P, Leurs R.Идентификация изоформ рецептора h4 крысы с различной экспрессией в мозге и сигнальными свойствами. Mol Pharmacol. 2001; 59: 1–8.

    34. Francis H, Franchitto A, Ueno Y, Glaser S, DeMorrow S, Venter J, Gaudio E, Alvaro D, Fava G, Marzioni M, Vaculin B, Alpini G. Агонист гистаминовых рецепторов h4 ингибирует рост желчных протоков у крыс BDL подавлением цАМФ-зависимого пути PKA / ERK1 / 2 / ELK-1. Lab Invest. 2007; 87: 473–487.

    35. Верхаак Р.Г., Ходли К.А., Пурдом Э., Ван В., Ци Й., Уилкерсон, доктор медицинских наук, Миллер С.Р., Динг Л., Голуб Т., Месиров Д.П., Алексей Г., Лоуренс М., О’Келли М., Тамайо П., Вейр Б.А. , Gabriel S, Winckler W, Gupta S, Jakkula L, Feiler HS, Hodgson JG, James CD, Sarkaria JN, Brennan C, Kahn A, Spellman PT, Wilson RK, Speed ​​TP, Gray JW, Meyerson M, Getz G, Perou CM, Hayes DN.Интегрированный геномный анализ определяет клинически значимые подтипы глиобластомы, характеризующиеся аномалиями PDGFRA, IDh2, EGFR и NF1. Раковая клетка. 2010; 17: 98–110.

    36. Филлипс Х.С., Харбанда С., Чен Р., Форрест В.Ф., Сориано Р.Х., Ву Т.Д., Мисра А., Нигро Дж.М., Колман Х., Сорочану Л., Уильямс П.М., Модрусан З., Фейерштейн Б.Г., Алдапе К. Молекулярные подклассы высоких глиома высокой степени позволяет прогнозировать прогноз, определять характер прогрессирования заболевания и напоминает стадии нейрогенеза. Раковая клетка.2006; 9: 157–173.

    37. Кристиансен Дж. Дж., Раджасекаран А. К.. Переоценка перехода эпителия в мезенхиму как предпосылку инвазии и метастазирования карциномы. Cancer Res. 2006; 66: 8319–8326.

    38. Brabletz T. Различать или нет — пути к метастазам. Нат Рев Рак. 2012; 12: 425–436.

    39. Калерт УД, Мациачик Д., Дусткам С., Орр Б.А., Саймонс Б., Богиль Т., Райтмайер Т., Принц М., Шуберт Дж., Нидерманн Г., Браблетц Т., Эберхарт К.Г., Никхах Г., Мацичик Дж.Активация канонической передачи сигналов WNT / бета-катенин усиливает подвижность in vitro клеток глиобластомы за счет активации ZEB1 и других активаторов эпителиально-мезенхимального перехода. Cancer Lett. 2012; 325: 42–53.

    40. Элиас М.К., Тозер К.Р., Зильбер Дж. Р., Михеева С., Дэн М., Моррисон Р.С., Мэннинг Т.С., Зильбергельд Д.Л., Глакин К.А., Рех Т.А., Ростомилы Р.К. TWIST экспрессируется в глиомах человека и способствует инвазии. Неоплазия. 2005; 7: 824–837.

    41. Хан С.П., Ким Дж.Х., Хан Ме, Сим Х.С., Ким К.С., Юн С., Пэк Си, Ким Б.С., О СО.SNAI1 участвует в пролиферации и миграции клеток глиобластомы. Cell Mol Neurobiol. 2011; 31: 489–496.

    42. Ян Х.В., Менон Л.Г., Блэк П.М., Кэрролл Р.С., Джонсон, доктор медицины. SNAI2 / Slug способствует росту и инвазии глиом человека. Рак BMC. 2010; 10: 301.

    43. Sunayama J, Matsuda K, Sato A, Tachibana K, Suzuki K, Narita Y, Shibui S, Sakurada K, Kayama T, Tomiyama A, Kitanaka C. Перекрестные помехи между путями PI3K / mTOR и MEK / ERK, участвующими в поддержание самообновления и туморогенности стволовых клеток глиобластомы.Стволовые клетки. 2010; 28: 1930–1939.

    44. Клебер С., Санчо-Мартинес I, Вистлер Б., Байзель А., Гифферс С., Хилл О., Тиманн М., Мюллер В., Сикора Дж., Кун А., Шрегльманн Н., Летелье Е., Зулиани С., Клуссманн С., Теодорчик М. , Gröne HJ, Ganten TM, Sültmann H, Tüttenberg J, von Deimling A, Regnier-Vigouroux A, Herold-Mende C, Martin-Villalba A. Да и PI3K связывают CD95, чтобы сигнализировать о вторжении в глиобластому. Раковая клетка. 2008; 13: 235–248.

    45. Пак С.М., Парк М.Дж., Квак Х.Дж., Ли ХК, Ким М.С., Ли С.Х., Парк И.С., Ри СН, Хонг С.Ионизирующее излучение усиливает секрецию матриксной металлопротеиназы-2 и инвазию клеток глиомы через сигнальные пути p38 / Akt и фосфатидилинозитол-3-киназы / Akt, опосредованные рецептором Src / эпидермального фактора роста. Cancer Res. 2006; 66: 8511–8519.

    46. Лу Дж. Т., Чжао В. Д., Хе В., Вэй В. Сигнальный путь ежа опосредует инвазию и метастазирование гепатоцеллюлярной карциномы через путь ERK. Acta Pharmacol Sin. 2012; 33: 691–700.

    47. Велпула К.К., Рехман А.А., Челлубоина Б., Дасари В.Р., Гонди С.С., Рао Дж.С., Вееравалли К.К.Инвазия стволовых клеток глиомы через регуляцию взаимосвязанного пути передачи сигналов ERK, интегрина альфа6 и N-кадгерина. Сотовый сигнал. 2012; 24: 2076–2084.

    48. Guo G, Yao W., Zhang Q, Bo Y. Олеаноловая кислота подавляет миграцию и инвазию злокачественных клеток глиомы путем инактивации сигнального пути MAPK / ERK. PLoS One. 2013; 8: e72079.

    49. Song Y, Luo Q, Long H, Hu Z, Que T, Zhang X, Li Z, Wang G, Yi L, Liu Z, Fang W, Qi S. Альфа-энолаза как потенциальный прогностический маркер рака способствует рост, миграция и инвазия клеток в глиому.Молочный рак. 2014; 13:65.

    50. Kleihues P, Burger PC, Scheithauer BW. Новая классификация опухолей головного мозга ВОЗ. Brain Pathol. 1993; 3: 255–268.

    Олигодезоксинуклеотиды стабилизируют Helios-экспрессирующие Foxp3 + Т-регуляторные клетки человека во время экспансии in vitro | Кровь

    Foxp3 + регуляторные Т-клетки (Treg) представляют собой уникальную субпопуляцию CD4 + Т-клеток, которые отвечают за самотолерантность и предотвращение аутоиммунных заболеваний. 1 Адоптивная инфузия Treg была предложена в качестве потенциальной терапии для профилактики реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD) после трансплантации стволовых клеток, отторжения трансплантата органа и для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как диабет I типа и рассеянный склероз. . 2,3 Было показано, что адоптивный перенос Foxp3 + Tregs на моделях мышей предотвращает острую и хроническую GVHD без отрицательного воздействия на реакцию трансплантата по сравнению с лейкемией. 4 Совсем недавно несколько групп сообщили, что совместный перенос расширенных Treg из образцов пуповины 5 или из периферической крови оказался как безопасным, 6 , так и в одном исследовании, чрезвычайно эффективным для предотвращения острой РТПХ после стволовых клеток. трансплантация. 7

    Несмотря на значительный энтузиазм в отношении адоптации Treg-терапии, еще предстоит решить несколько серьезных проблем. Во-первых, для большинства клинических применений терапии Treg потребуется большое количество клеток, и в настоящее время изучаются оптимальные методы расширения Treg. Экспансия высокоочищенных популяций человеческих Treg также часто приводит к потере экспрессии Foxp3 во время процесса экспансии.Во-вторых, в отличие от исследований на мышах, экспрессия Foxp3 может быть легко индуцирована во время стимуляции in vitro обычных Т-клеток человека. 8 Т-клетки, индуцированные in vitro для экспрессии Foxp3, часто лишены фенотипа Treg, продолжают вырабатывать эффекторные цитокины и лишены супрессивной функции in vitro. 8 Таким образом, экспрессия Foxp3 не может считаться полностью надежным маркером функциональных человеческих Treg.

    Для решения этих проблем использовалось несколько подходов.Комбинированное использование нескольких поверхностных маркеров (CD127 lo и CD25 hi ) облегчило выделение более высокообогащенных популяций Т-клеток Foxp3 + с меньшим загрязнением CD25 в активированных Т-клетках. 9 Добавление ингибиторов пути рапамицина (mTOR) у млекопитающих, таких как рапамицин, блокирует распространение контаминирующих обычных Т-клеток и способствует росту Treg, но чистота более 60% редко достигается после нескольких раундов расширения в зависимости от стартовой популяции. 10 CD4 + CD25 + CD45RA + Foxp3 + Т-клетки, хотя небольшая подгруппа (5-30%) пула Foxp3 + у взрослых, по-видимому, имеет большую склонность к размножаются в культуре и обладают повышенной стабильностью экспрессии Foxp3 по сравнению с CD4 + CD25 + CD45RO + Foxp3 + Т-клетками. 11

    Foxp3 + Tregs можно разделить на 2 потенциально различных субпопуляции.Одна популяция образуется в тимусе и получила название естественных (n) Treg. Вторая популяция образуется экстратимически в периферических участках и называется индуцированными (i) Treg или адаптивными Treg. Мы недавно продемонстрировали 12 , что фактор транскрипции Helios, член суперсемейства генов Ikaros, экспрессируется в 70% Т-клеток Foxp3 + как мыши, так и человека. Foxp3 + Т-клетки Helios в первую очередь являются iTreg, так как Т-клетки Foxp3 + , индуцированные in vitro, представляют собой Т-клетки Helios и Foxp3 + , индуцированные in vivo в ответ на пероральное введение антигена, антиген вводится внутривенно или Т-клетки, активируемые в ответ на лимфопению, — это почти исключительно Helios .

    Здесь мы дополнительно охарактеризуем субпопуляции Treg Foxp3 + Helios + и Foxp3 + Helios с точки зрения эпигенетических изменений в локусе Foxp3, их способности продуцировать эффекторные цитокины и стабильности экспрессии Foxp3 в течение нескольких дней. до недель экспансии in vitro. Мы демонстрируем, что добавление 25-мерного ДНК-олигонуклеотида случайного состава в течение короткого периода во время начальной экспансии Foxp3 + Tregs приводит к длительной стабилизации субпопуляции Foxp3 + Helios + .Взятые вместе, наши результаты предполагают, что Foxp3 + Helios + Tregs представляют собой оптимальную субпопуляцию для клеточной биотерапии у людей и что добавление ДНК-олигонуклеотидов во время размножения культур будет способствовать размножению этой мощной и более стабильной субпопуляции.

    Стимулированные или покоящиеся клетки рестимулировали PMA (12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат, 50 нг / мл) и иономицином (1 мкг / мл) в течение 4 часов в присутствии Golgistop (0.75 мкл / мл) при 37 ° C. Клетки фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали на экспрессию Foxp3 и Helios, а также на IL-2-FITC, IFNγ-PECy7 и IL17A-APC. Все антитела были приобретены в eBioscience.

    Собирали свежевыделенные или увеличенные in vitro Treg и дважды промывали PBS. Экстракцию геномной ДНК проводили с помощью набора DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN). Фиксированные окрашенные клетки отсортировывали с помощью FACS, дважды промывали в PBS и экстрагировали геномную ДНК с помощью набора QIAamp DNA FFPE fabric (QIAGEN).Конверсия бисульфита, пиросеквенирование и анализ данных были выполнены EpigenDx. Анализировали одиннадцать цитозингуаниновых динуклеотидов (CpG) области специфического деметилирования Treg человека (TSDR) (от -2376 до -2263 от сайта начала транскрипции (TSS) ENST00000376207). Процент метилирования каждого образца указывает среднее значение всех 11 CpG.

    Первоначально мы оценили возможность того, что нестабильность может быть связана с различными свойствами субпопуляций Helios + и Helios .Один эпигенетический маркер, который использовался для отличия nTreg от iTreg, — это статус метилирования Treg-специфической области деметилирования (TSDR) гена Foxp3. 13 Деметилирование области TSDR коррелирует с тимическим происхождением Т-клеток Foxp3 + и стабильной экспрессией Foxp3, тогда как Т-клетки, индуцированные для экспрессии Foxp3 in vitro, имеют полностью метилированную область TSDR и теряют экспрессию Foxp3 in vivo или in пробирка. Чтобы определить, существует ли корреляция между экспрессией Helios и статусом метилирования TSDR, мы выделили 4 различных подмножества CD4 + (Foxp3 + Helios + , Foxp3 + Helios , Foxp3 Helios + и Foxp3 Helios ) с помощью FACS-сортировки фиксированных, свежевыделенных CD4 + Т-клеток человека (рис. 1A) и проанализировали метилирование TSDR в каждой субпопуляции.Как и ожидалось, Т-клетки Foxp3 экспрессировали полностью метилированный TSDR независимо от экспрессии Helios (рис. 1А). Напротив, клетки Foxp3 + Helios + были полностью деметилированы у всех доноров, тогда как область TSDR подмножества Fox3 + Helios была метилирована на ~ 45%. Одна интерпретация этих результатов заключается в том, что субпопуляция Foxp3 + Helios состоит из 2 субпопуляций, одна из которых экспрессирует полностью метилированный TSDR, который потенциально может потерять экспрессию Foxp3 при экспансии in vitro, тогда как вторая, вероятно, представляет популяцию с большая стабильность экспрессии Foxp3.

    Рисунок 1

    Foxp3 + Helios + Tregs имеют равномерно деметилированный TSDR и не продуцируют воспалительные цитокины. (A) CD4 + CD25 hi клетки были выделены из лейкоцитарной пленки мужских доноров (n = 7), зафиксированы-проницаемы и окрашены для определения внутриклеточной экспрессии Foxp3 и Helios. Окрашенные клетки были разделены на 4 фракции. Верхний график показывает состояние окрашивания и стробирования перед сортировкой.Для анализа метилирования ДНК TSDR, бисульфитную модификацию геномной ДНК проводили после экстракции из отсортированных фракций. Метилирование CpG считывали и анализировали методом пиросеквенирования. Результаты от 7 доноров показаны на нижнем графике. (B) CD4 + Клетки CD25 + были отсортированы из лейкоцитарной пленки и стимулированы связанными с планшетом анти-CD3 и анти-CD28 антителами в течение 6 дней. Затем клетки размножали в течение дополнительных 5 дней с помощью магнитных шариков, покрытых анти-CD3 / анти-CD28 антителами (CD3 / CD28-шариками).Внутриклеточное окрашивание на IFNγ (n = 4), IL17A (n = 5) и IL2 (n = 4) проводили после рестимуляции PMA и иономицином. Верхний точечный график — это пример, показывающий стробирование каждого подмножества, разделенного экспрессией Foxp3 и Helios в расширенной популяции.

    Рисунок 1

    Foxp3 + Helios + Tregs имеют равномерно деметилированный TSDR и не продуцируют воспалительные цитокины. (A) CD4 + CD25 hi клетки были выделены из лейкоцитарной пленки мужских доноров (n = 7), зафиксированы-проницаемы и окрашены для определения внутриклеточной экспрессии Foxp3 и Helios.Окрашенные клетки были разделены на 4 фракции. Верхний график показывает состояние окрашивания и стробирования перед сортировкой. Для анализа метилирования ДНК TSDR, бисульфитную модификацию геномной ДНК проводили после экстракции из отсортированных фракций. Метилирование CpG считывали и анализировали методом пиросеквенирования. Результаты от 7 доноров показаны на нижнем графике. (B) CD4 + Клетки CD25 + были отсортированы из лейкоцитарной пленки и стимулированы связанными с планшетом анти-CD3 и анти-CD28 антителами в течение 6 дней.Затем клетки размножали в течение дополнительных 5 дней с помощью магнитных шариков, покрытых анти-CD3 / анти-CD28 антителами (CD3 / CD28-шариками). Внутриклеточное окрашивание на IFNγ (n = 4), IL17A (n = 5) и IL2 (n = 4) проводили после рестимуляции PMA и иономицином. Верхний точечный график — это пример, показывающий стробирование каждого подмножества, разделенного экспрессией Foxp3 и Helios в расширенной популяции.

    В качестве другого подхода мы измерили продукцию эффекторных цитокинов размноженными клетками.Ранее мы продемонстрировали, что низкий процент (1-5%) недавно эксплантированных Т-клеток Foxp3 + продуцировал эффекторные цитокины (IL-2, IFNγ) и что большинство цитокин-продуцирующих клеток находились в Foxp3 + Helios субпопуляция. 14 Мы отсортировали CD4 + CD25 + Т-клетки от нормальных доноров и стимулировали клетки в течение 11 дней связанными с планшетом анти-CD3 и анти-CD28 в присутствии IL-2. Хотя примерно 90% (данные не показаны) исходной популяции составляли Foxp3 + , после 12 дней экспансии только примерно 50% клеток оставались Foxp3 + (Рисунок 1B).При рестимуляции in vitro с помощью PMA / иономиина 5-20% расширенной субпопуляции Foxp3 + Helios продуцировали IL-2, IL-17A или IFNγ, тогда как частота продуцентов цитокинов оставалась низкой в ​​Foxp3 . + Helios + субпопуляция (рисунок 1B). Эти эксперименты предполагают, что одним из основных факторов, контролирующих поддержание экспрессии Foxp3 Tregs при экспансии in vitro, является гетерогенность исходной популяции. Субпопуляция Foxp3 + Helios , по-видимому, содержит высокий процент Treg с метилированными TSDR, которые потенциально могут привести к потере экспрессии Foxp3.Эта же субпопуляция также содержит высокий процент клеток, продуцирующих эффекторные цитокины, которые не были бы идеальными для клеточной иммунотерапии.

    Одна из целей этого исследования состояла в том, чтобы идентифицировать цитокин или небольшую молекулу, которая способствовала бы преимущественной экспансии Foxp3 + Helios + субпопуляции Treg. Первоначально мы выбрали 2 потенциальных кандидата, TGFβ и агонист TLR9 CpG ODN.TGFβ может индуцировать экспрессию Foxp3 в Т-клетках человека, и некоторые исследования показали, что он может усиливать поддержание экспрессии Foxp3. В некоторых исследованиях утверждается, что включение определенных TLR отменяет опосредованное Treg супрессию за счет снижения экспрессии Foxp3, 14 , но другие утверждают, что это приводит к большей жизнеспособности Treg Foxp3 + без потери экспрессии Foxp3. 15 Мы могли легко продемонстрировать, что человеческие Tregs экспрессировали TLR9, но в отличие от других исследований 16 мы не смогли обнаружить экспрессию TLR8 или TLR7 (дополнительный рисунок 1, доступный на веб-сайте Blood ; см. Ссылку на дополнительные материалы вверху онлайн-статьи).Когда отсортированные CD4 + CD25 hi CD4 + Т-клетки были размножены в присутствии TGFβ и агониста TLR9 в течение 5 дней, частота позитивных клеток Foxp3 + Helios + была выше, чем размноженных клеток. в отсутствие TGFβ и ODN (данные не показаны). Интересно, что когда 5-дневные размноженные клетки были промыты и повторно стимулированы в течение дополнительных 7 дней в отсутствие TGFβ и CpG ODN, клетки, первоначально подвергнутые TGFβ / ODN, сохранили высокую частоту Foxp3 + Helios + клеток. , тогда как клетки, первоначально размножавшиеся в отсутствие TGFβ / ODN, имели заметно сниженный процент клеток Foxp3 + Helios + .CpG ODN был основным фактором, вовлеченным в стабилизацию популяции Foxp3 + Helios + , поскольку клетки, размножавшиеся в присутствии только TGFβ, имели лишь умеренное увеличение Foxp3 + Helios + клеток, тогда как клетки увеличивались. с одним ODN напоминал популяцию, получавшую комбинацию TGFβ / ODN (Фигуры 2A-B).

    Рисунок 2

    Добавление CpG ODN увеличивает частоту Foxp3 + Helios + клеток во время размножения in vitro. (A) FACS-отсортированные клетки CD4 + CD25 + (левый график, квадратные ворота) стимулировали связанными с планшетом анти-CD3 и анти-CD28 в присутствии TGFβ (5 нг / мл) и CpG ODN. (ODN2395, 2,5 мкМ) в течение 5 дней. Затем клетки промывали и инкубировали еще 2 дня в среде, содержащей IL-2. Окрашивание Foxp3 и Helios проводили на закрытых жизнеспособных клетках CD4 + . (B) Резюме опосредованного CpG ODN усиления клеток Foxp3 + Helios + во время размножения.Условия культивирования для стимуляции и размножения такие же, как в панели A. Доноры (n = 15) были в возрасте от 19 до 75 лет, и все они были мужчинами. (C) CpG ODN увеличивает частоту клеток Foxp3 + Helios + как в свежевыделенных, так и в предварительно активированных Т-клетках. Клетки выделяли и стимулировали в течение 5 дней, как показано на панели A. CpG ODN добавляли в моменты времени, указанные на фигуре.

    Рисунок 2

    Добавление CpG ODN увеличивает частоту клеток Foxp3 + Helios + во время размножения in vitro. (A) FACS-отсортированные клетки CD4 + CD25 + (левый график, квадратные ворота) стимулировали связанными с планшетом анти-CD3 и анти-CD28 в присутствии TGFβ (5 нг / мл) и CpG ODN. (ODN2395, 2,5 мкМ) в течение 5 дней. Затем клетки промывали и инкубировали еще 2 дня в среде, содержащей IL-2. Окрашивание Foxp3 и Helios проводили на закрытых жизнеспособных клетках CD4 + . (B) Резюме опосредованного CpG ODN усиления клеток Foxp3 + Helios + во время размножения.Условия культивирования для стимуляции и размножения такие же, как в панели A. Доноры (n = 15) были в возрасте от 19 до 75 лет, и все они были мужчинами. (C) CpG ODN увеличивает частоту клеток Foxp3 + Helios + как в свежевыделенных, так и в предварительно активированных Т-клетках. Клетки выделяли и стимулировали в течение 5 дней, как показано на панели A. CpG ODN добавляли в моменты времени, указанные на фигуре.

    Для определения продолжительности воздействия ODN на поддержание клеток Foxp3 + Helios + отсортированные клетки CD4 + CD25 hi размножали в присутствии или отсутствии ODN в течение 5 дней, промывали и рестимулировали еще на 6 или 19 дней.Заметное повышение частоты клеток Foxp3 + Helios + наблюдалось после 12 дней культивирования, и это усиление все еще было заметным после в общей сложности 25 дней культивирования, даже несмотря на некоторое снижение частоты клеток Foxp3 +. клеток Helios + наблюдали в клетках, первоначально подвергнутых воздействию ODN (дополнительная фигура 2). Следует также отметить, что постоянное присутствие ODN в течение всех 12 дней расширения привело к небольшому увеличению (75.3% против 63,7%) по частоте клеток Foxp3 + Helios + по сравнению с клетками, которые только что обрабатывались в течение первых 5 дней (рис. 2C). Интересно, что когда клетки, которые ранее размножались в течение 5 дней в отсутствие ODN, были рестимулированы еще на 7 дней в присутствии ODN, стабилизация (38,1% против 22,2%) частоты Foxp3 + Helios + клеток (рис. 2С). Таким образом, ODN может также оказывать стабилизирующее действие на клетки Foxp3 + Helios + , которые ранее стимулировались в отсутствие ODN.

    Затем мы сравнили статус метилирования TSDR клеток Foxp3 + , размножающихся в присутствии или в отсутствие ODN в течение 19–21 дней. Обработка CpG ODN приводила к высокой частоте клеток Foxp3 + Helios + (68% против 19%). TSDR всей популяции клеток, размноженных в присутствии CpG ODN, был очень сильно (79%) деметилирован, тогда как TSDR клеток, увеличившихся в отсутствие ODN, был деметилирован только <25% (рис. 3A).

    Рисунок 3

    Т-клетки Foxp3 + Helios + , размноженные в присутствии CpG ODN, являются функциональными Treg. (A) TSDR CD4 + CD25 + Т-клеток, размноженных в присутствии CpG ODN, полностью деметилирован. FACS-отсортированные клетки CD4 + CD25 + стимулировали связанными с планшетом анти-CD3 и анти-CD28 в присутствии CpG ODN (2.5 мкМ) в течение 5 дней. Затем клетки размножались от 14 до 16 дней в среде, содержащей IL-2, без CpG ODN, и анализ метилирования выполнялся, как показано на рисунке 1A. (B) Двухнедельные расширенные Treg-клетки, обработанные CpG ODN, обрабатывали, как показано на фиг. 1B, PMA / иономицином и анализировали на внутриклеточную экспрессию цитокинов. (C) Популяция клеток, размноженных в присутствии CpG ODN, проявляет большую супрессивную активность, чем клетки, размноженные в отсутствие ODN. Tregs увеличивали, как на панели A, и культивировали в течение 3 дней при различных соотношениях со свежевыделенными клетками CD4 + CD25 (5 × 10 4 клеток / лунку) в присутствии γ-облученных PBMC (5 × 10 4 ) и растворимый анти-CD3 (2 мкг / мл). 3 Включение H-TdR измеряли в течение последних 18 часов культивирования.

    Рисунок 3

    Т-клетки Foxp3 + Helios + , размноженные в присутствии CpG ODN, являются функциональными Treg. (A) TSDR CD4 + CD25 + Т-клеток, размноженных в присутствии CpG ODN, полностью деметилирован. FACS-отсортированные клетки CD4 + CD25 + стимулировали связанными с планшетом анти-CD3 и анти-CD28 в присутствии CpG ODN (2.5 мкМ) в течение 5 дней. Затем клетки размножались от 14 до 16 дней в среде, содержащей IL-2, без CpG ODN, и анализ метилирования выполнялся, как показано на рисунке 1A. (B) Двухнедельные расширенные Treg-клетки, обработанные CpG ODN, обрабатывали, как показано на фиг. 1B, PMA / иономицином и анализировали на внутриклеточную экспрессию цитокинов. (C) Популяция клеток, размноженных в присутствии CpG ODN, проявляет большую супрессивную активность, чем клетки, размноженные в отсутствие ODN. Tregs увеличивали, как на панели A, и культивировали в течение 3 дней при различных соотношениях со свежевыделенными клетками CD4 + CD25 (5 × 10 4 клеток / лунку) в присутствии γ-облученных PBMC (5 × 10 4 ) и растворимый анти-CD3 (2 мкг / мл). 3 Включение H-TdR измеряли в течение последних 18 часов культивирования.

    Популяции клеток, размноженные в течение 2 недель в присутствии ODN, рестимулировали в течение 4 часов с помощью PMA / иономицина и продуцирования цитокинов на закрытых Foxp3 + Helios + и Foxp3 + Helios — измеряли популяции . Foxp3 + Helios + Tregs, увеличенные в присутствии ODN, продуцировали низкие или неопределяемые уровни IL-2, IFNγ или IL-17, тогда как Foxp3 + Helios клетки продуцировали значительные уровни всех 3 цитокинов. (Рисунок 3B).Наконец, популяция Т-клеток Foxp3 + , которая была увеличена в присутствии ОДН, которая содержала высокий процент Т-клеток Foxp3 + Helios + , проявила большую подавляющую активность в стандартном тесте подавления in vitro. (Рисунок 3C), чем клетки, которые были увеличены в отсутствие ODN. Взятые вместе, эти исследования демонстрируют, что клетки Foxp3 + Helios + , которые были размножены в присутствии ODN, сохраняют все свойства полностью функциональных Treg.

    Коэкспрессия CD25 и низких уровней CD127 была использована для отличия CD25 + Foxp3 + от CD25 + Foxp3 клеток Teff. 10 Чтобы определить взаимосвязь между экспрессией Foxp3 / Helios и уровнем экспрессии CD127, мы отсортировали свежевыделенные CD4 + Т-клетки на 3 подмножества на основе экспрессии CD25 и CD127 и проанализировали относительную экспрессию Foxp3 и Helios ( Рисунок 4A).Большинство клеток CD127 hi CD25 int не экспрессировали ни Foxp3, ни Helios. Оба CD127 low CD25 hi и CD127 low CD25 int содержали высокий процент Foxp3 + Helios + Т-клеток. Мы отсортировали эти 3 субпопуляции и расширили их в присутствии или в отсутствие CpG ODN (рисунок 4B). ODN оказал минимальное влияние на состав клеток CD127 hi CD25 int , за исключением небольшого увеличения в подмножестве Foxp3 + Helios (11.От 3% до 21,7%, Рисунок 4B слева 2 панели). Добавление ODN к росту клеток CD127 low CD25 hi увеличивало выделение клеток Foxp3 + Helios + (68,2% против 89%) на 5 день, и это повышение сохранялось еще 7 дней. дни культивирования в отсутствие ОДН. Наиболее интересные результаты наблюдались с клетками CD127 low CD25 int , которые быстро утратили клетки Foxp3 + Helios + (73% к 22.7%) в течение первых 5 дней роста, но сохранил клетки Foxp3 + Helios + при расширении в присутствии ODN (от 73% до 71%) и поддерживал эту частоту Foxp3 + Helios + клетки после дополнительных 7 дней размножения в отсутствие ODN. Эти результаты предполагают, что субпопуляция клеток Foxp3 + Helios + , которые экспрессируют более низкие уровни CD25, намного менее стабильны, чем те, которые экспрессируют более высокие уровни CD25, но что экспансия в присутствии ODN оказывает основное влияние на Foxp3. / Стабилизация гелиоса в этой субпопуляции.

    Рисунок 4

    Повышенная частота Foxp3 + Helios + Т-клеток наблюдается в присутствии CpG ODN во время размножения различных популяций Treg. (A) Стратегия сортировки, используемая для выделения CD127 hi CD25 + , CD127 lo CD25 int и CD127 lo 25 hi Т-клеток. Экспрессия Foxp3 и Helios была проанализирована в различных популяциях после сортировки.(B) CpG ODN-опосредованное повышение частоты клеток Foxp3 + Helios + в отсортированных популяциях. (C) Стратегия сортировки для выделения CD25 + CD45RA + и CD25 + CD45RA субпопуляций Treg. Экспрессию Foxp3 и Helios в клетках проводили после сортировки. (D) CpG ODN-опосредованное увеличение частоты клеток Foxp3 + Helios + в отсортированных CD25 + CD45RA + и CD25 + CD45RA субпопуляций Treg после активации и последующего увеличения.(E) Усиление клеток Foxp3 + Helios + в 2-недельных CD25 + CD45RA + Treg (n = 5).

    Рисунок 4

    Повышенная частота Foxp3 + Helios + Т-клеток наблюдается в присутствии CpG ODN во время размножения различных популяций Treg. (A) Стратегия сортировки, используемая для выделения CD127 hi CD25 + , CD127 lo CD25 int и CD127 lo 25 hi Т-клеток.Экспрессия Foxp3 и Helios была проанализирована в различных популяциях после сортировки. (B) CpG ODN-опосредованное повышение частоты клеток Foxp3 + Helios + в отсортированных популяциях. (C) Стратегия сортировки для выделения CD25 + CD45RA + и CD25 + CD45RA субпопуляций Treg. Экспрессию Foxp3 и Helios в клетках проводили после сортировки. (D) CpG ODN-опосредованное увеличение частоты клеток Foxp3 + Helios + в отсортированных CD25 + CD45RA + и CD25 + CD45RA субпопуляций Treg после активации и последующего увеличения.(E) Усиление клеток Foxp3 + Helios + в 2-недельных CD25 + CD45RA + Treg (n = 5).

    В дополнение к использованию уровней экспрессии CD127 для выделения Foxp3 + Treg-клеток, совместная экспрессия CD25 и CD45RA определила субпопуляцию Foxp3 + Т-клеток, которые считаются наивными, 11 демонстрируют более стабильные Foxp3 экспрессия при экспансии in vitro, 17 и экспрессия полностью деметилированных TSDR. 18 Мы отсортировали клетки CD45RA + и CD45RA из CD4 + CD25 + CD127 low периферические CD4 + Т-клетки и обнаружили, что экспрессия Helios была одинаковой в RA + и RA популяции (рис. 4C). Затем группы стимулировали в присутствии или в отсутствие CpG ODN в течение 6 дней, промывали и размножали в отсутствие ODN в течение дополнительных 7 дней (фигуры 4D-E). После 6 дней стимуляции без ODN 94% клеток CD25 + CD45RA + остались Foxp3 + , тогда как субпопуляция CD25 + CD45RA начала терять экспрессию Foxp3 (98% от 77.6%). Частота клеток Foxp3 + Helios + также была несколько выше в субпопуляции CD25 + CD45RA + (81%), чем в группе CD25 + CD45RA (66%). В обеих популяциях клеток снизилась частота Т-клеток Foxp3 + Helios + после дополнительных 7 дней экспансии в отсутствие ODN, хотя общая частота клеток Foxp3 + оставалась стабильной. Добавление ODN к обеим группам привело к увеличению частот клеток Foxp3 + Helios + в течение 7 дней размножения в отсутствие ODN.Таким образом, клетки Foxp3 + CD45RA + , по-видимому, демонстрируют более стабильную экспрессию Foxp3 при размножении in vitro, но частота клеток Foxp3 + Helios + действительно снижается и может быть восстановлена ​​как в клетках CD45RA + . и популяции CD45RA путем стимуляции в присутствии ODN.

    Наши исследования до сих пор продемонстрировали, что экспансия Foxp3 + Tregs в присутствии CpG ODN приводит к повышенной частоте Foxp3 + Helios + Т-клеток.Однако мы не продемонстрировали напрямую, что это усиление является результатом прямого воздействия ODN на существующие клетки Foxp3 + Helios + или подавляющего эффекта на распространение Foxp3 + Helios или Foxp3 . — Helios клеток, которые также присутствуют в исходных популяциях. Чтобы решить эту проблему, мы подготовили исходную популяцию, которая содержала 50% клеток Foxp3 + Helios + , а не более высокие проценты, использованные в других исследованиях (рис. 5A).В этих условиях мы могли непосредственно наблюдать дифференциальные эффекты ODN на клетки Helios + и Helios . Мы метили смесь CFSE и стимулировали клетки в течение 6 дней в присутствии или в отсутствие ODN. Стабилизация клеток Foxp3 + Helios + наблюдалась после размножения в присутствии ODN (фиг. 5A, 30% против 11,1%). Добавление CpG ODN немного подавляло распространение всех 3 подмножеств (Foxp3 + Helios + , Foxp3 + Helios и Foxp3 Helios ; рисунок 5A, правые гистограммы).Поскольку не было значительных различий в пролиферации между популяциями Foxp3 + и Foxp3 в присутствии отсутствия ODN (Рисунок 5B), повышенная частота подмножества Foxp3 + Helios + в Группа, обработанная ODN, соответствует прямому стабилизирующему эффекту ODN на эту субпопуляцию.

    Рисунок 5

    CpG ODN действует непосредственно на клетки Foxp + Helios + . Повышение частоты Foxp3 + Helios + Treg с помощью CpG ODN не является вторичным по отношению к дифференциальным эффектам ODN на распространение Foxp3 + Helios + , Foxp3 + Helios , или Foxp3 Helios субпопуляции. После сортировки была создана смесь, содержащая 50% CD4 + CD25 + и 50% CD4 + CD25 Т-клеток. После мечения CFSE смесь стимулировали в течение 5 дней связанными с планшетом анти-CD3 / CD28 в присутствии или в отсутствие CpG ODN (2.5 мкМ). (A) Степень разведения CFSE анализировали путем стробирования по 3 подмножествам (Foxp3 + Helios + , Foxp3 + Helios и Foxp3 Helios ). (B) Пролиферация Т-клеток Foxp3 + и Foxp3 идентична в присутствии и отсутствии ODN. (C) Оптимальный размер ODN не ингибирует экспансию Treg. CD4 + CD127 lo CD25 + клетки (1 × 10 5 ) были выделены с помощью FACS-сортировки, стимулированы в течение 5 дней в присутствии ODN разной длины (10-мерный, 10-звенный ODN; 25-мерный , ODN длиной 25 п.н .; 50 мер, ODN длиной 50 п.н .; 100 мер, ODN длиной 100 п.н.).Стимулированные клетки промывали и размножали в течение дополнительных 7 дней в отсутствие ODN. Выход клеток и процент клеток Foxp3 + и Helios + определяли количественно с помощью FACS. На графике показано абсолютное количество (среднее ± стандартное отклонение) ячеек Foxp3 + Helios + (открытая рамка) и не-Foxp3 + Helios + клеток (закрытая рамка), извлеченных на 12-й день. 1 из 4 независимых экспериментов от разных доноров.

    Рисунок 5

    CpG ODN действует непосредственно на ячейки Foxp + Helios + . Повышение частоты Foxp3 + Helios + Treg с помощью CpG ODN не является вторичным по отношению к дифференциальным эффектам ODN на распространение Foxp3 + Helios + , Foxp3 + Helios , или Foxp3 Helios субпопуляции. После сортировки была создана смесь, содержащая 50% CD4 + CD25 + и 50% CD4 + CD25 Т-клеток. После мечения CFSE смесь стимулировали в течение 5 дней связанными с планшетом анти-CD3 / CD28 в присутствии или в отсутствие CpG ODN (2.5 мкМ). (A) Степень разведения CFSE анализировали путем стробирования по 3 подмножествам (Foxp3 + Helios + , Foxp3 + Helios и Foxp3 Helios ). (B) Пролиферация Т-клеток Foxp3 + и Foxp3 идентична в присутствии и отсутствии ODN. (C) Оптимальный размер ODN не ингибирует экспансию Treg. CD4 + CD127 lo CD25 + клетки (1 × 10 5 ) были выделены с помощью FACS-сортировки, стимулированы в течение 5 дней в присутствии ODN разной длины (10-мерный, 10-звенный ODN; 25-мерный , ODN длиной 25 п.н .; 50 мер, ODN длиной 50 п.н .; 100 мер, ODN длиной 100 п.н.).Стимулированные клетки промывали и размножали в течение дополнительных 7 дней в отсутствие ODN. Выход клеток и процент клеток Foxp3 + и Helios + определяли количественно с помощью FACS. На графике показано абсолютное количество (среднее ± стандартное отклонение) ячеек Foxp3 + Helios + (открытая рамка) и не-Foxp3 + Helios + клеток (закрытая рамка), извлеченных на 12-й день. 1 из 4 независимых экспериментов от разных доноров.

    Поскольку во всех вышеперечисленных исследованиях (рисунки 1, 2, 3–4) использовались 22-24-мерные ODN, представляло интерес определить оптимальный размер ODN при стабилизации клеток Foxp3 + Helios + . путем сравнения активности ODN в диапазоне от 10 до 100 мер (рис. 5C).10 мер не проявлял активности по сравнению с необработанными клетками, тогда как 50 мер и 100 мер увеличивали частоту клеток Foxp3 + Helios + после 5 дней культивирования, но также были умеренно токсичными, поскольку их использование приводило к снижение выхода клеток. Оптимальные результаты были получены с 25-мерным ODN, включая стабилизацию частоты клеток Foxp3 + Helios + и увеличение абсолютного числа восстановленных клеток Foxp3 + Helios + после 12 дней размножения.Хотя ODN действительно оказывают незначительное отрицательное влияние на пролиферацию клеток, как измерено с помощью разведения CFSE (фиг. 5A), присутствие ODN требуется только в течение первых 5 дней культивирования. После удаления ODN обработанные клетки увеличиваются со скоростью, немного превышающей контрольные, что приводит к более высокому выходу клеток на 12 день (фиг. 5C).

    До сих пор мы предполагали, что CpG ODN, используемый в наших исследованиях, опосредует его эффекты на стабилизацию Т-клеток Foxp3 + Helios + , действуя через TLR9, который экспрессируется в человеческих Treg Foxp3 + (дополнительный рисунок 1). .Неожиданно, экспансия Treg в присутствии как агониста TLR9, так и антагониста TLR9 (ODN TTAGGG) привела к стабилизации подмножества Foxp3 + Helios + (фигура 6A). Когда и CpG ODN, и антагонист TLR9 были одновременно добавлены к культурам размножения, не наблюдали отмены стабилизации подмножества Foxp3 + Helios + (данные не показаны). Хотя мы не смогли обнаружить экспрессию TLR8 или TLR7 в Treg с помощью RT-PCR, мы сравнили эффекты агониста TLR8 (ssRNA40) и агониста TLR7 (CL264) с агонистом TLR9.Ни TLR8, ни агонисты TLR7 не оказали никакого эффекта на стабилизацию Т-клеток Foxp3 + Helios + , тогда как CpG ODN увеличивал частоту этого подмножества, как отмечалось в других наших исследованиях (Рисунок 6B). Таким образом, маловероятно, что CpG ODN-обеспечиваемая стабилизация клеток Foxp3 + Helios + опосредуется сигнальным путем TLR и что др. Распознающий нуклеотид сенсор участвует в этой стабилизации.

    Рисунок 6

    Случайные ODN также стабилизируют Т-клетки Foxp3 + Helios + . (A) Как агонист TLR9, так и антагонист TLR9 стабилизируют Helios + Foxp3 + Treg. Клетки выделяли, как показано на фиг. 5A, и стимулировали в присутствии 2,5 мкМ CpG ODN или ODN TTAGGG в течение указанного времени. (B) Агонисты TLR7 и TLR8 не стабилизируют Tregs Helios + Foxp3 + . Клетки выделяли, как на панели A, и стимулировали в присутствии CpG ODN, 10 мкМ оцДНК40 (CL264, агонист TLR8), оцДНК40 (агонист TLR7) или оцРНК41 (отрицательный контроль для оцДНК40).(C) Случайные последовательности ODN стабилизируют Helios + Foxp3 + Treg. Левая панель: CD4 + CD127 lo CD25 + клетки были отсортированы и стимулированы в течение 5 дней в присутствии 2,5 мкМ ODN TTAGGG или ODN NNNGGG. Затем клетки размножали гранулами против CD3 / CD28 в отсутствие ODN и окрашивали на экспрессию Foxp3 и Helios через 8 дней. Правая панель, те же условия, что и на левой панели, за исключением того, что были добавлены разные ODN (4X означает 4-кратное повторение [24 меры] нуклеотидов из 6 пар оснований).(D) Стабилизация экспрессии Foxp3 и Helios с помощью ODN требует физической стабильности и надлежащего размера (> 10 мер) ODN. CD4 + CD127 lo CD25 hi Клетки стимулировали и размножали так же, как панель (C), в присутствии 10-мерного ODN (ODNps10) с фосфоротиоатной основой, 25-мерного ODN (ODNpe25) с фосфодиэфирной основой и фосфотиоата подкрепленный 25-мерным ODN (ODNps25) в концентрации 2,5 мкМ. (E) ODN локализованы в цитозоле Treg. Отсортированные по MACS CD4 + Т-клетки выделяли из лейкоцитов, стимулировали связанными с планшетом анти-CD3 / CD28 в течение 18 часов в присутствии биотин-5-ODN или немеченых ODN, а затем промывали 3 раза в буфере для окрашивания FACS. .Внеклеточный и внутриклеточный биотин-5-ОДН в стимулированных клетках окрашивали стрепавидинами, конъюгированными с AlexaFluor 488 или 546 (Invitrogen). Для конфокального микроскопического анализа фиксированные и окрашенные клетки помещали в монтажную среду Vectashield с 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; синий, Vector Laboratories). Изображения получали с помощью лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss), оснащенного масляно-иммерсионным объективом Plan-Apochromat 63 × / 1,4, при температуре окружающей среды и обрабатывали с помощью программного обеспечения ZEN 2009 (Carl Zeiss).Белая полоса соответствует 10 мкм.

    Рисунок 6

    Случайные ODN также стабилизируют Т-клетки Foxp3 + Helios + . (A) Как агонист TLR9, так и антагонист TLR9 стабилизируют Helios + Foxp3 + Treg. Клетки выделяли, как показано на фиг. 5A, и стимулировали в присутствии 2,5 мкМ CpG ODN или ODN TTAGGG в течение указанного времени. (B) Агонисты TLR7 и TLR8 не стабилизируют Tregs Helios + Foxp3 + . Клетки выделяли, как на панели A, и стимулировали в присутствии CpG ODN, 10 мкМ оцДНК40 (CL264, агонист TLR8), оцДНК40 (агонист TLR7) или оцРНК41 (отрицательный контроль для оцДНК40).(C) Случайные последовательности ODN стабилизируют Helios + Foxp3 + Treg. Левая панель: CD4 + CD127 lo CD25 + клетки были отсортированы и стимулированы в течение 5 дней в присутствии 2,5 мкМ ODN TTAGGG или ODN NNNGGG. Затем клетки размножали гранулами против CD3 / CD28 в отсутствие ODN и окрашивали на экспрессию Foxp3 и Helios через 8 дней. Правая панель, те же условия, что и на левой панели, за исключением того, что были добавлены разные ODN (4X означает 4-кратное повторение [24 меры] нуклеотидов из 6 пар оснований).(D) Стабилизация экспрессии Foxp3 и Helios с помощью ODN требует физической стабильности и надлежащего размера (> 10 мер) ODN. CD4 + CD127 lo CD25 hi Клетки стимулировали и размножали так же, как панель (C), в присутствии 10-мерного ODN (ODNps10) с фосфоротиоатной основой, 25-мерного ODN (ODNpe25) с фосфодиэфирной основой и фосфотиоата подкрепленный 25-мерным ODN (ODNps25) в концентрации 2,5 мкМ. (E) ODN локализованы в цитозоле Treg. Отсортированные по MACS CD4 + Т-клетки выделяли из лейкоцитов, стимулировали связанными с планшетом анти-CD3 / CD28 в течение 18 часов в присутствии биотин-5-ODN или немеченых ODN, а затем промывали 3 раза в буфере для окрашивания FACS. .Внеклеточный и внутриклеточный биотин-5-ОДН в стимулированных клетках окрашивали стрепавидинами, конъюгированными с AlexaFluor 488 или 546 (Invitrogen). Для конфокального микроскопического анализа фиксированные и окрашенные клетки помещали в монтажную среду Vectashield с 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; синий, Vector Laboratories). Изображения получали с помощью лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss), оснащенного масляно-иммерсионным объективом Plan-Apochromat 63 × / 1,4, при температуре окружающей среды и обрабатывали с помощью программного обеспечения ZEN 2009 (Carl Zeiss).Белая полоса соответствует 10 мкм.

    Затем мы определили оптимальный порядок или мотив последовательности ODN, необходимый для стабилизации Foxp3 + Helios + Treg. Последовательность TTA из ODN TTAGGG была заменена случайно выбранными нуклеотидами (NNN), а затем протестирована на ее влияние на стабильность Treg (фигура 6C). ODN NNNGGG ведет себя идентично ODN TTAGGG. Более того, полностью рандомизированный ODN (ODN NNNNNN) также эффективно стабилизировал клетки Foxp3 + Helios + .Поскольку ODN, по-видимому, воспринимается неспецифичным для последовательности образом, мы исследовали, играет ли состав нуклеотидного основания какую-либо роль стабилизации. Исключение A, T, G или C из случайно синтезированного ODN не уменьшало стабилизирующий эффект (данные не показаны ) . В отличие от фосфоротиоатных ODN (ODNps), фосфодиэфирные ODN (ODNpe) не смогли стабилизировать Treg Foxp3 + Helios + , даже когда ODNpe добавляли каждые 24 часа во время 5-дневной культивирования (фиг. 6D).

    Чтобы обратиться к клеточной локализации предполагаемого сенсора ODN, мы синтезировали 5′-биотин-конъюгированный ODN (Biotin-ODN). Меченый биотином ODN был так же активен, как ODNps в стабилизации экспрессии Foxp3 + Helios + Т-клеток (данные не показаны). Очищенные CD4 + Т-клетки стимулировали в присутствии биотин-ODN в течение 18 часов, а затем оценивали внутриклеточную и внеклеточную экспрессию ODN с использованием 2 различных флуоресцентно-конъюгированных стрептавидинов (фигура 6E слева).В некоторых клетках биотин-ОДН был обнаружен на внеклеточной мембране, но все клетки обладали биотин-ОДН внутриклеточно. Картина окрашивания биотин-ОДН была идентична в подмножествах Foxp3 Helios и Foxp3 + Helios + . При анализе с помощью конфокальной микроскопии биотин-ОДН не был обнаружен в ядре или связан с ядерной мембраной. Все ODN были агрегированы в гранулированные органеллы в цитоплазме (рис. 6E). Анализ динамики биотин-ODN на FACS показал, что ODN быстро исчезал после промывки во время фазы расширения в отсутствие внеклеточных ODN (дополнительная фигура 3).

    Большинство исследований, направленных на оптимизацию экспансии Treg in vitro, было сосредоточено на получении максимального увеличения Treg наивысшей чистоты с точки зрения экспрессии Foxp3. Хотя наивысшая степень чистоты может быть достигнута с исходной популяцией Treg, очищенной с помощью FACS, сортировка клеток до сих пор не использовалась для получения Treg в условиях надлежащей производственной практики, поэтому в исходных препаратах использовались Treg, очищенные на основе высокой экспрессия CD25 и низкая экспрессия CD127 с использованием методов разделения магнитных гранул, таких как CliniMACS. 19,20 После 3 недель размножения in vitro только 60% -70% очищенных гранулами Tregs сохраняют экспрессию Foxp3. 20 Было трудно определить, является ли это снижение вторичным по отношению к потере Foxp3 клетками, которые изначально были Foxp3 + , или чрезмерным ростом Т-клеток Foxp3 , которые загрязняли исходные образцы.

    Мы сообщили, что экспрессия фактора транскрипции Helios является маркером происходящих из тимуса nTregs, 12 , тогда как Foxp3 + Helios Т-клетки, вероятно, являются iTregs.Мы охарактеризовали несколько свойств субпопуляций Helios + и Helios Foxp3. Во-первых, Foxp3 + Helios + Tregs имеют полностью деметилированные области TSDR локуса Foxp3, тогда как популяции клеток Foxp3 + Helios деметилированы только на 50%. Этот результат наиболее согласуется с гетерогенностью популяции Treg Helios , которая, вероятно, связана со сниженной стабильностью экспрессии Foxp3 in vivo и in vitro. 15 Во-вторых, более высокий процент Т-клеток, продуцирующих эффекторные цитокины Foxp3 + , присутствовал в субпопуляции Helios , и частота клеток, продуцирующих эффекторные цитокины, в этой субпопуляции увеличивалась (примерно в 10 раз) после размножения. in vitro. Также было показано, что продуцирующие IFNγ Tregs Foxp3 + имеют метилированные TSDR и являются Helios у пациентов с диабетом I типа. 21 Вероятно, что Helios + Treg представляет собой гораздо более стабильную популяцию, которая с меньшей вероятностью превратится в клетки Teff в ходе воспалительной реакции in vivo.

    Целью данного исследования было разработать условия для селективного распространения подмножества Foxp3 + Helios + in vitro для потенциального использования в исследованиях клеточной терапии. Первоначально мы исследовали эффекты TGFβ и агониста ODN TLR9 на рост Т-клеток Foxp3 + in vitro. Агонист ODN TLR9 увеличивал частоту Т-клеток Foxp3 + Helios + в увеличенной популяции.Интересно, что эффекты ODN наблюдались после 5 дней воздействия, но также сохранялись в течение дополнительных 16 дней после того, как клетки были промыты и дополнительно размножены в отсутствие ODN. Эффекты ODN не были опосредованы косвенно индуцированием гибели клеток Foxp3 + Helios (данные не показаны) или изменением скорости пролиферации либо Foxp3 + Helios + , либо Foxp3 +. Helios подмножеств, а скорее за счет прямого воздействия на популяцию Foxp3 + Helios + , что приводит к стабилизации экспрессии Foxp3.Эффекты ODN также наблюдались, когда мы увеличивали CD4 + CD25 + CD45RA + Т-клетки, субпопуляцию Treg, которая, как было показано, более стабильна при экспансии in vitro 18 и обладает большей пролиферативной способностью, чем подмножество CD4 + CD25 + CD45RO + .

    Хотя эффекты ODN наблюдались при культивировании высокообогащенных клеток, очищенных с помощью сортировщика CD4 + CD25 hi CD127 low Foxp3 + T-клеток, ODN стабилизировал экспрессию Foxp3 / Helios в Tregs, очищенных с помощью магнитных гранул, содержащих более низкий процент Foxp3 + Т-клеток в исходной популяции, а также стабилизация экспрессии Foxp3 / Helios в отсортированных клетках CD4 + CD25 int , содержащих всего 70% клеток Foxp3 + .Стабилизирующие эффекты ODN были очень последовательными при использовании клеток, выделенных из лейкоцитов от нескольких доноров в широком возрастном диапазоне (рис. 2B). Некоторая степень стабилизации Foxp3 / Helios наблюдалась даже в популяциях клеток, которые сначала были увеличены в отсутствие ODN и утратили значительную экспрессию Foxp3 / Helios. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что ODN может усиливать стабилизацию Foxp3 / Helios в Tregs, выбранных менее строгими методами, чем сортировка клеток, и обеспечивать больший выход Treg, начиная с большей популяции клеток.Несколько других подходов были использованы для стабилизации экспрессии Foxp3 в культурах разрастания Treg, включая рапамицин, 10 ретиноевую кислоту 22 или иммунодепрессивные цитокины (IL-10, TGFβ). Хотя некоторые из этих исследований кажутся многообещающими, особенно при использовании Treg, очищенных методом проточной сортировки, Treg, очищенные гранулами, увеличенные за несколько циклов, даже в присутствии рапамицина, снизили процентное содержание Т-клеток Foxp3 + . 22 В предварительных исследованиях мы сравнили эффекты рапамицина с ODN на стабилизацию экспрессии Foxp3 и Helios.Хотя стимуляция в присутствии рапамицина приводила к увеличению общего процента клеток Foxp3 + , только стимуляция в присутствии ODN приводила к стабилизации популяции Foxp3 + Helios + (дополнительная фигура 4).

    Мы начали эти исследования с ODN, который был хорошо охарактеризован как агонист TLR9, но антагонист TLR был столь же эффективным, если не более эффективным, при стабилизации экспрессии Foxp3 / Helios.Более того, любая случайная последовательность ODN также способна стабилизировать экспрессию Foxp3 / Helios, и отсутствие какого-либо одного нуклеотида (аденина, гуанина, цитидина, тимина) не снижает стабилизирующую активность. Оптимальным размером ODN был 25-мерный, поскольку 10-мерный был неэффективным, а более длинные ODN, по-видимому, оказывали негативное влияние на жизнеспособность Treg в культурах размножения. Мы не смогли обнаружить внутриклеточное присутствие ODN с фосфодиэфирным скелетом или коротких ODN с фосфотиоатным скелетом (дополнительный рисунок 5) после 18 часов инкубации.Поли РНК ODN также не смог стабилизировать экспрессию Foxp3. Таким образом, не похоже, чтобы сети ODN функционировали через какой-либо известный TLR.

    В настоящее время у нас очень мало информации о клеточной мишени действия ODN. Путем иммуноокрашивания с использованием биотин-меченного ODN и конфокальной микроскопии мы могли продемонстрировать, что ODN, по-видимому, локализован в цитоплазматических пузырьках, а не в ядре, что согласуется с более ранними исследованиями, демонстрирующими, что ODN с фосфоротиоатной основой поглощается клетками через рецептор. опосредованный эндоцитоз, а затем локализуется в эндосомах и лизосомах. 23 Однако также возможно, что партнер по связыванию ODN находится на поверхности клетки и что активация Т-клеток индуцирует клеточное поглощение такого комплекса. Следует также отметить, что оптимальная концентрация ODN, используемая в этих исследованиях (2,5 мкМ), примерно в 10 раз выше, чем у агонистов TLR, используемых для модуляции функции иммунных клеток. Таким образом, сильно заряженный ODN может неспецифически вмешиваться в несколько клеточных процессов. Хотя ODN не нацелен конкретно на TLR9, остается возможность, что ODN может вмешиваться в клеточный транспорт TLR9 или ферментативное расщепление TLR9 в эндолизосоме. 24

    Хотя наши исследования использования ODN были полностью выполнены in vitro, взаимодействие Treg с ДНК, высвобождаемой из умирающих клеток во время воспалительного ответа, также может функционировать аналогичным путем для стабилизации экспрессии Foxp3 / Helios и усиления функции Treg. Напротив, ДНК, высвобождаемая из умирающих клеток в микроокружении опухоли, также может стабилизировать экспрессию Foxp3 / Helios и приводить к Treg-опосредованному ингибированию противоопухолевых клеток Teff.Наконец, поскольку ODN уже доступны для клинического использования и могут быть удалены из культур через несколько дней без отрицательного воздействия на размножение, вполне вероятно, что этот протокол можно легко адаптировать для приготовления Treg клинического уровня. Действительно, экспансия Tregs, выделенных очисткой гранул MACS и размноженных в присутствии ODN, также экспрессировала высокий процент клеток Foxp3 + Helios + (дополнительная фигура 6).

    Онлайн-версия этой статьи содержит информационное дополнение.

    Расходы на публикацию этой статьи были частично оплачены за счет оплаты страницы. Поэтому и исключительно для того, чтобы указать на этот факт, данная статья помечена как «реклама» в соответствии с разделом 18 USC 1734.

    Вклад: Y.C.K. разработал все экспериментальные стратегии, выполнил большинство экспериментов и написал статью; Р.Б. внесла рисунок 3С; J.Y. внесенный рисунок 6F; A.G. участвовал во всех экспериментальных проектах по стимуляции и разрастанию регуляторных Т-клеток человека; A.M.T. участвовал во всех экспериментальных проектах, связанных с выражением Helios; D.Q.T. внес вклад в экспериментальную установку по выделению и культивированию Treg человека in vitro; и E.M.S. руководил проектом, интерпретировал данные и редактировал статью.

    Раскрытие информации о конфликте интересов: авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

    Для корреспонденции: д-р Итан М. Шевач, Лаборатория иммунологии, NIAID, Национальные институты здравоохранения, 10 Center Dr, Bldg 10, Rm 11N315, Bethesda, MD 20892; электронная почта: [email protected]

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *