Номер 226 по математике 5 класс: Номер №226 — ГДЗ по Математике 5 класс: Никольский С.М.

a Схема когорты мышей Vκ * MYC и экспериментальный рабочий процесс для сбора единичных клеток. Графика частично создана с использованием BioRender.com. b Бремя заболевания в когорте, определенное с помощью измерений М-белка с помощью SPEP. Статистическое сравнение нескольких групп проводилось с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона (двусторонний) с поправкой на множественное тестирование (Benjamini-Hochberg). Коробчатые диаграммы представляют распределение каждого измерения в определенных группах, где центральный прямоугольник охватывает межквартильный диапазон, центральная линия представляет собой медианное значение, а «усы» над и под прямоугольником показывают значение 1.5-кратный межквартильный размах. Перечислены только значения P для статистически значимых сравнений. Точки данных представляют измерения от биологически независимых животных (контроль ( n = 3), ранний MM ( n = 5), int-MM ( n = 3) и активный MM ( n = 7)). c tSNE визуализация 17 504 клеток линии B, окрашенных по идентификатору образца. d tSNE визуализация клеток линии B, окрашенных по шкале сигнатуры гена плазматических клеток (Hay SB et al. ²⁸ ). e tSNE визуализация клеток линии B, окрашенных в соответствии с относительной экспрессией генов, специфичных для указанного типа клеток. f tSNE визуализация плазматических клеток, идентифицированных по критериям, отображенным в ( d ) и ( e ), окрашенных относительной экспрессией трансгена Vκ * MYC ( tMYC ). г Столбиковая диаграмма, показывающая распределение нормальных и злокачественных плазматических клеток по образцам. В EMM2 не было обнаружено злокачественных клеток, поэтому он был удален из последующих анализов злокачественных клеток.Исходные данные представлены в SourceData_Fig. 1.xlsx. EMM: ранний MM, IMM: средний MM, AMM: активный MM.

Чтобы различать типы клеток в пределах BM, мы использовали комбинацию уменьшения размерности и неконтролируемой кластеризации, чтобы получить интегрированную карту 52 транскрипционных кластеров (Supplementary Fig. 1b). Затем к каждому кластеру были отнесены клоны клеток с использованием SingleR ²⁶ , который аннотирует данные scRNA-seq с использованием контрольного набора с известными метками. Для нашего набора данных по клеткам ВМ мы использовали ссылку ImmGen ²⁷ , состоящую из профилей массовой экспрессии генов из высокоочищенных популяций иммунных и гематопоэтических клеток (дополнительный рис.1в, г). Это выявило 17 504 клетки из линии B-клеток (рис. 1c), которые мы дополнительно уточнили, оценивая профили экспрессии с использованием набора генов плазматических клеток BM, созданного с помощью Human Cell Atlas ²⁸ (рис. 1d). Это, вместе с экспрессией канонических маркерных генов Cd19 и Sdc1 (рис. 1e), позволило различить 10 344 B-клеток и 7 160 плазматических клеток в BM этой когорты (дополнительные данные 1).

Предыдущие исследования массовой экспрессии генов в MM используют методы отбора клеток, которые не делают различий между нормальными и злокачественными плазматическими клетками, что приводит к потенциально загрязненным профилям экспрессии злокачественных клеток.Мы смогли сделать это различие в нашем наборе данных scRNA-seq, измерив уровни экспрессии трансгена Vκ * MYC ( tMYC ), которые выявили небольшую популяцию нормальных плазматических клеток со значительно более низкой экспрессией tMYC (рис. 1f). Профили экспрессии этой популяции также получили более низкие оценки для наборов генов, состоящих из транскрипционных мишеней MYC (Chesi et al. ¹⁷ , Schuhmacher et al. ²⁹ , Menssen et al. ³⁰ , дополнительный рис. 1e – g) и далее) поддерживая их идентичность как нормальных, незлокачественных плазматических клеток.В соответствии с этим, только нормальные плазматические клетки были идентифицированы у контрольных мышей того же возраста, в то время как доля нормальных плазматических клеток прогрессивно снижалась от ранней / инт-ММ до активной-ММ (рис. 1g). Более того, доля злокачественных клеток в каждой опухоли из наших данных scRNA-seq сильно коррелировала с исходными измерениями M-белка ( R = 0,890, P = 7,401e-07, дополнительный рис. 1h), что подтверждает наше использование этот маркер для определения прогрессирования заболевания. В соответствии с классификациями стадий заболевания, определенными выше, у мышей в группе активного MM было значительно больше злокачественных клеток по сравнению со всеми другими группами заболеваний и контрольными мышами (дополнительный рис.1i). Напротив, у всех мышей с ранней ММ и инт-ММ было менее 5% злокачественных клеток (без существенной разницы между группами). Таким образом, измерение профилей экспрессии генов на уровне отдельных клеток показало, что нормальные и злокачественные плазматические клетки имеют разные программы транскрипции, и позволило различить эти популяции в образцах.

Основная злокачественная программа охватывает спектр миеломных заболеваний

Используя данные scRNA-seq из чисто злокачественных клеток, мы затем определили основную молекулярную программу, разделяемую всеми злокачественными клетками в модели мыши Vκ * MYC, независимо от стадии заболевания.В этом и во всех последующих анализах злокачественные клетки определялись как плазматические клетки, не входящие в описанный выше кластер нормальных плазматических клеток. Сначала мы выполнили анализ дифференциальной экспрессии (DE) между злокачественными клетками на каждой стадии заболевания и нормальными плазматическими клетками (дополнительные данные 2). Затем мы отобрали дифференциально экспрессируемые гены, которые перекрывались во всех группах стадий заболевания, что дало основной набор из 226 дифференциально экспрессируемых генов (171 с повышенной регуляцией, 55 с пониженной регуляцией), общих для злокачественных клеток на всех стадиях заболевания (рис.2a, дополнительный рисунок 2a и дополнительные данные 3). Эти гены включали tMYC и Ccnd2 , что согласуется с гипотезой о ранней и универсальной дисрегуляции циклина D в патогенезе MM ¹⁶ . Чтобы прояснить биологическую значимость программы основных злокачественных клеток, мы выполнили анализ обогащения набора генов с использованием 226 общих дифференциально экспрессируемых генов и построили 20 положительно и отрицательно обогащенных терминов (рис. 2b и дополнительные данные 4).Как и ожидалось, положительно обогащенные термины были связаны с регуляцией транскрипции MYC, патогенезом миеломы и общей биологией рака. Интересно, что многие из отрицательно обогащенных терминов из этого анализа были связаны с иммунными процессами, такими как реакция «трансплантат против хозяина» и врожденный иммунитет, что позволяет предположить, что злокачественные клетки экспрессируют молекулярную программу, которая способствует нарушению регуляции иммунитета. Действительно, это согласуется с результатами Zavidij et al. которые продемонстрировали, что иммунная дисфункция возникает на ранней стадии патогенеза миеломы ¹³ .В этом анализе также были идентифицированы другие сигнатуры, которые затрагивают ранее не сообщаемые процессы в биологии болезни Vκ * MYC, включая сигнатуры, связанные с отключением опухолевого супрессора TCF21 , мутациями KRAS и конститутивной активацией онкогена RHOA . Это, в свою очередь, может указывать на то, что дополнительные онкогенные попадания приобретаются на ранних этапах опухолевого процесса Vκ * MYC и сохраняются на протяжении всей эволюции заболевания.

a Тепловая карта дифференциально экспрессируемых генов, общих для всех злокачественных клеток у мышей Vκ * MYC, по сравнению с нормальными плазматическими клетками (FDR <0,05). Тепловая карта разделена по вертикали, чтобы показать нормальные плазматические клетки (nPC) по сравнению со злокачественными плазматическими клетками (mPC), последние из которых дополнительно разделены по группам стадий заболевания. Верхняя и нижняя панели тепловой карты разделяют гены с повышенной и пониженной регуляцией соответственно. Показано подмножество из 100 случайно выбранных клеток на группу стадий заболевания, и данные представляют масштабированные значения экспрессии (любые значения вне диапазона от -2 до 2 были обрезаны). b Лучшие 20 положительно / отрицательно обогащенных терминов из анализа обогащения набора генов MSigDB (H, C2, C6, FDR <0,05), вычисленных с использованием основных генов с повышенной / пониженной регуляцией, идентифицированных с помощью анализа DE в ( a ). c — e Гены, специфичные для стадии заболевания, которые значительно по-разному экспрессируются между группами стадий заболевания. Цветные точки представляют собой среднюю экспрессию образцов стадии заболевания для каждого гена, а столбики ошибок показывают стандартную ошибку среднего.Статистические сравнения проводились с использованием двустороннего t-критерия с последующей поправкой на множественное тестирование (Бонферрони). Серые точки данных представляют собой среднюю экспрессию соответствующих генов в клетках каждого биологически независимого животного (Cont1 = 44 клетки, Cont2 = 72 клетки, Cont3 = 148 клеток, EMM1 = 45 клеток, EMM4 = 52 клетки, EMM5 = 71 клетка, IMM1 = 206 ячеек, IMM2 = 88 ячеек, IMM3 = 149 ячеек, AMM1 = 2,003 ячеек, AMM2 = 830 ячеек, AMM3 = 1379 ячеек, AMM4 = 822 ячеек, AMM5 = 302 ячеек, AMM6 = 323 ячейки, AMM7 = 310 ячеек).Гены сгруппированы в соответствии с паттерном экспрессии на протяжении всей прогрессии. Исходные данные представлены в SourceData_Fig. 2.xlsx.

Незначительно различные программы экспрессии лежат в основе прогрессии

Вышеприведенный анализ выявил набор перекрывающихся генов, общих для злокачественных клеток по всему спектру заболевания, поэтому мы затем спросили, возникают ли отдельные молекулярные программы продольно на протяжении всего прогрессирования. Используя анализ DE, мы определили временные паттерны экспрессии, которые специфичны для злокачественных клеток на каждой стадии прогрессирования (см. «Методы», рис.2c – e, дополнительный рисунок 2b, c и дополнительные данные 5). Это выявило 21 ген с уровнями экспрессии, которые значительно менялись на протяжении прогрессии (Fig. 2c-e), и чей продольный паттерн экспрессии совпадает с одной из трех различных групп. Первая группа генов состояла из Gm2a и Myl4 , экспрессия которых прогрессивно снижалась во время прогрессирования (рис. 2c). Вторая группа, экспрессия которой достигла пика на стадии ранней стадии заболевания MM (рис. 2d), состояла из Il5ra , рецептора цитокина, Mgmt , метилтрансферазы, критически важной для стабильности генома, и Tsc22d1 , проапоптотического супрессор опухолей.Это, таким образом, предполагает, что злокачественные клетки на ранних стадиях заболевания увеличивают экспрессию апоптотических регуляторов и стабилизаторов генома, но эти процессы могут постепенно теряться во время прогрессирования. Третья группа генов продемонстрировала временную структуру, характеризующуюся пиком экспрессии на промежуточной стадии заболевания («Пик-промежуточный», рис. 2e), и включала гены, связанные с иммунными процессами, такими как передача сигналов цитокинов ( Osm , Lilr4b ). , система комплемента ( Fcnb ) и клеточная адгезия ( Clec4e , Sell ).Гены, экспрессия которых достигла пика во время промежуточной стадии прогрессирования, также включали F630028O10Rik , днРНК, которая, как сообщается, играет роль в модуляции ангиогенеза опухоли ³¹ , Plaur , рецептор урокиназы, участвующий в миграции клеток, регуляции клеточного цикла и клеточной адгезии. ³² и Ctsh , лизосомальная цистеиновая протеиназа, экспрессия которой коррелировала со злокачественным прогрессированием опухолей простаты ³³ . Таким образом, прогрессирование заболевания у мышей Vκ * MYC сопровождается изменчивостью транскрипции в компартменте злокачественных клеток.Однако, учитывая, как мало дифференциально экспрессируемых генов было общим у мышей в пределах данной группы стадий заболевания, мы предположили, что внутри / межопухолевая гетерогенность может присутствовать у мышей Vκ * MYC и объясняет тонкость изменений экспрессии, наблюдаемых в долгосрочном плане.

CNV являются источником неоднородности опухоли у мышей Vκ * MYC

Чтобы оценить, демонстрируют ли злокачественные клетки гетерогенность, обусловленную соматическими изменениями генома, мы вывели CNV из наших данных scRNA-seq с использованием алгоритма InferCNV ³⁴ (см. «Методы» подробнее).Этот анализ выявил обширные вариации числа копий в злокачественном компартменте всех мышей Vκ * MYC (рис. 3a и дополнительный рис. 3a). Это включало ранее сообщенные CNV, такие как увеличение chr1, chr6, chr16, chr18 и потеря chr5 и chr14 ³⁵ . CNVs, о которых ранее не сообщалось в этой модели, включали субхромосомные потери chr3, chr9 и chr17 и субхромосомные потери chr15. Примечательно, что многие из этих CNV не были общими для всех мышей Vκ * MYC, даже у мышей с одной и той же стадии заболевания (например,g., потеря chr12 в AMM1, увеличение chr18 в IMM3). Разделив клетки на группы, имеющие согласованные паттерны CNV, мы обнаружили, что опухоли Vκ * MYC состоят из 4-8 субпопуляций злокачественных клеток с различными профилями CNV (рис. 3a и дополнительный рис. 3a, b), что подчеркивает силу scRNA- seq для выделения злокачественных субпопуляций, не обнаруженных массовыми методами. Присутствие множества клеточных субпопуляций с различными профилями CNV было очевидным на всех стадиях заболевания (рис. 3а и дополнительный рис.3а, б). Это, таким образом, предполагает, что геномная диверсификация опухолей начинается на ранней стадии эволюции миеломы, подобно тому, что было описано у людей ^9,36 , и продолжается на протяжении всей прогрессии.

a Тепловая карта вариаций числа копий в масштабе всего генома (CNV), выведенная из данных scRNA-seq злокачественных плазматических клеток, как определено с помощью InferCNV ³⁴ .Столбцы представляют положение генома по хромосомам. Строки представляют CNV, усредненные по субпопуляции CNV внутри выборки, которые были идентифицированы с использованием метода иерархической кластеризации / случайного леса ward.D2, реализованного с помощью analysis_mode = ‘subclusters’ в inferCNV. Размеры субпопуляций, управляемых CNV, варьировались от 1 до 979 клеток (в среднем 44). Высота каждой субпопуляции CNV пропорциональна ее фракционному составу в данной опухоли. b Визуализация UMAP злокачественных клеток каждой мыши с активным ММ, окрашенных транскрипционным кластером.Размер кластеров, обусловленных экспрессией генов, составлял от 10 до 474 клеток (медиана 79). c Визуализация UMAP злокачественных клеток от каждой мыши с активной MM, окрашенной субпопуляцией CNV. d Гистограмма, показывающая распределение субпопуляций CNV (заполнить) по кластерам транскрипции ( x -ось). Результаты для ( b — d ) организованы для каждой мыши с активной MM в столбцы с именами субъектов и количеством клеток / транскрипционных кластеров, перечисленных выше.Исходные данные представлены в SourceData_Fig. 3.xlsx. EMM: ранний MM, IMM: средний MM, AMM: активный MM.

Приведенный выше анализ подтверждает, что компартмент злокачественных клеток мышей Vκ * MYC проявляет внутри- и межопухолевую гетерогенность, несмотря на то, что управляется одним и тем же онкогенным трансгеном MYC. Однако он также выявляет несколько CNV, которые являются общими для субпопуляций злокачественных клеток по всему спектру заболеваний, в первую очередь, потерю chr5. Чтобы лучше понять биологические основы потери chr5 у мышей Vκ * MYC, мы выполнили анализ обогащения с использованием генов, дифференциально экспрессируемых между клетками с делецией chr5 (del (5)) и клетками с chr5 дикого типа (chr5WT) (дополнительные данные 6, 7). ).Неудивительно, что этот анализ выявил активацию процессов, связанных с хромосомной нестабильностью в клетках с del (5), включая «ответ на двухцепочечный разрыв ДНК», «Рекрутирование ATM-опосредованного фосфорилирования репарационных и сигнальных белков при двухцепочечных разрывах ДНК», «Обработка концов двухцепочечных разрывов ДНК» и «Старение, вызванное повреждением ДНК / теломерным стрессом» (дополнительный рис. 3c). Чтобы понять, как потеря chr5 может передаваться пациентам с миеломой человека, мы выполнили сопоставление ортологичных генов от мыши к человеку (дополнительный рис.3d и дополнительные данные 8). Подавляющее большинство генов chr5 мыши картировано в трех хромосомах человека: chr4, chr7 и chr12 (930/1196 генов). Однако подмножество генов, также картированных в хромосомах человека, как сообщается, удалено у пациентов с предшественником миеломы (chr1p, chr2q и chr13q) ³⁷ , предполагая, что эти гены могут опосредовать патогенные эффекты потери chr5 у мышей Vκ * MYC и, в свою очередь, играть роль в прогрессировании миеломы от предшествующей болезни.

Предполагаемый CNV-анализ наших данных scRNA-seq подтверждает существование внутриопухолевой гетерогенности, которая является хорошо известным явлением при раке.Однако менее понятно, вызывают ли эти события неоднородность транскрипции и результирующие биологические эффекты. Таким образом, мы сопоставили определяемые CNV субпопуляции с транскрипционными кластерами (рис. 3b), определенными неконтролируемым кластеризацией данных scRNA-seq от мышей Vκ * MYC с активным-MM. Подобно нашему анализу CNV, транскрипционная кластеризация показала, что компартмент злокачественных клеток мышей Vκ * MYC состоит из нескольких молекулярных субпопуляций на мышь (3-13 транскрипционных кластеров, рис.3б). Тот факт, что образцы с одинаковым количеством клеток не имели одинакового количества транскрипционных кластеров (например, AMM2 и AMM4, AMM6 и AMM7), подтверждает, что диапазон количества транскрипционных кластеров не является просто артефактом различий в количестве ячеек, профилированных по образцам. Затем мы оценили, вызвана ли эта транскрипционная гетерогенность субклональными CNV, выведенными выше, путем изучения распределения субпопуляций, управляемых CNV, в каждом транскрипционном кластере.При этом мы наблюдали экземпляры большинства CNV-управляемых транскрипционных кластеров (Fig. 3c, d). Например, в AMM1 транскрипционный кластер 4 в основном состоял из клеток из субпопуляции CNV 3, определяемой del (5) и del (12). Сходным образом, в AMM4, транскрипционный кластер 0 в основном состоял из клеток из субпопуляции CNV 1, что определяется субхромосомным усилением хромосомы 9. Это подтверждает, что субклональные CNVs могут оказывать существенное влияние на формирование отдельных транскрипционных кластеров.Однако большинство субпопуляций, управляемых CNV, были распределены по нескольким транскрипционным кластерам (рис. 3d), и мы не обнаружили значимой корреляции между количеством субпопуляций, управляемых CNV, и количеством транскрипционных кластеров ( R = -0,597, P = 0,1567, дополнительный рисунок 3e). Более того, эта транскрипционная гетерогенность сохранялась, когда были удалены потенциально смешанные гены, связанные с диссоциацией ³⁸ и гены митохондриального / рибосомного / клеточного цикла (дополнительный рис.4). Таким образом, наши данные надежно подтверждают, что вариабельность транскрипции должна управляться дополнительными источниками помимо субклональных событий CNV. В свою очередь, мы затем сосредоточились на определении биологических путей, связанных с кластерами транскрипции у мышей с активным ММ.

Консервированные программы транскрипции в опухолях Vκ * MYC

Для дальнейшего изучения факторов гетерогенности в кластерах транскрипции, определенных на рис. 3b, мы объединили DE и анализ обогащения для определения кластер-специфических путей в опухолях Vκ * MYC (дополнительные данные 9, 10).Значительно обогащенные термины пути для каждого транскрипционного кластера затем сравнивали попарно со всеми другими терминами пути, специфичными для кластера, с использованием индекса сходства Жаккара, который выявил две различные программы транскрипции с репрезентативными кластерами от всех семи мышей с активным ММ (рис. 4a): Программа сходства A (11 кластеров, средний индекс Жаккара = 0,641) и программа сходства B (9 кластеров, средний индекс Жаккара = 0,660). Остальные 21 кластер показали ограниченное сходство (средний индекс Жаккара = 0.054), подтверждая, что расхождение транскрипции является характерной чертой прогрессирования заболевания. Как показано на дополнительном рисунке 5, молекулярные процессы, связанные с этими дивергентными кластерами, включали иммунную систему (врожденный иммунитет, передача сигналов цитокинов), клеточные ответы на стресс (тепловой стресс, ионы металлов) и передачу сигналов через такие медиаторы, как MAP-киназа, ядерные рецепторы и WNT. Таким образом, помимо событий уровня CNV, транскрипционная гетерогенность в злокачественном компартменте мышей Vκ * MYC также управляется другими механизмами, которые, вероятно, включают внешние вклады из микроокружения опухоли.

a Тепловая карта индекса Жаккара между значительно обогащенными терминами Reactome по 41 кластеру внутриопухолевых злокачественных клеток. Группы кластеров с повышенным сходством (программы подобия) были определены в соответствии с методом полной связи для иерархической кластеризации и помечены под тепловой картой. Столбцы аннотированы информацией, относящейся к идентичности образца, фазе клеточного цикла и экспрессии Mki67 / Top2a . b Карта терминов Reactome со значительным обогащением кластеров злокачественных клеток из программы подобия A (ISR-GCN2). Полная иерархия каждого пути Reactome показана для контекста, но только значительно обогащенные общие пути выделены оранжевым цветом. c Оценка генного набора для указанных сигнатур Reactome, рассчитанная с использованием программы Seurat’s AddModuleScore по группам болезней в данных Vκ * MYC (контроль = 264 клетки, ранний MM = 168 клеток, int-MM = 443 клетки, активный MM = 5969 клеток).Коробчатые диаграммы в пределах графиков скрипки представляют собой распределение каждого измерения в определенных группах, где центральный прямоугольник охватывает межквартильный диапазон, центральная линия представляет собой медианное значение, а «усы» над и под прямоугольником показывают значение 1,5 × межквартильный диапазон. Статистическое сравнение нескольких групп (нормальные ПК по сравнению с каждой группой с заболеванием Vκ * MYC) проводили с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона (двусторонний) с поправкой на множественное тестирование (Benjamini-Hochberg). Исходные данные представлены в SourceData_Fig.4.xlsx.

Хотя миеломные опухоли претерпевают транскрипционную дивергенцию во время прогрессирования, определенные биологические процессы были общими для субпопуляции клеток, общих для всех опухолей. Поэтому мы стремились исследовать биологические процессы, управляющие этими общими транскрипционными программами. Предыдущие исследования одноклеточного рака выявили программу транскрипции, связанную с повторяющейся пролиферацией клеток, во многих раковых опухолях человека ³⁹ , и, таким образом, мы исследовали, была ли какая-либо из общих транскрипционных программ связана с этим процессом.Действительно, кластеры программы подобия B были обогащены терминами пути, связанными с клеточным циклом, включая «поддержание хромосомы», «контрольные точки клеточного цикла» и «клеточный цикл, митотический» (дополнительные данные 10), экспрессировали высокие уровни генов канонического клеточного цикла, таких как Mki67 и Top2a (рис. 4a) и преимущественно состояли из циклических ячеек (рис. 4a, среднее значение G2 / M 73,99 ± 11,16% в кластерах программы подобия B против 2,95 ± 4,28% для всех других кластеров). Это согласуется с субпопуляцией высокопролиферативных злокачественных клеток, описанной у пациентов с ММ, которые обычно составляют ~ 2% опухоли ⁴⁰ .Хотя эта популяция более распространена у мышей Vκ * MYC (в среднем 12,9 ± 7,7%, дополнительный рис. 6a), аналогичные диапазоны наблюдались у пациентов с ММ, причем более высокие индексы пролиферации коррелировали с худшими исходами ⁴¹ . Таким образом, эти результаты могут отражать неблагоприятные эффекты нарушения регуляции MYC в биологии миеломы. Наконец, эти пролиферативные кластеры состояли из нескольких субклонов CNV, что позволяет предположить, что программы пролиферации оказывают более сильное влияние на экспрессию генов, чем субклональные события CNV (дополнительный рис.6б).

Затем мы исследовали другой набор терминов, общих для субпопуляции клеток во всех опухолях с активным ММ (программа сходства A), который выявил интересный паттерн биологических путей, включая «трансляцию» и «ответ EIF2AK4 на аминокислоту. дефицит »(рис. 4b и дополнительные данные 10). GCN2 (белок, кодируемый EIF2AK4 ) представляет собой одно плечо пути интегрированного стрессового ответа (ISR), посредством которого клетки адаптируются к различным стрессам, таким как вирусная инфекция, депривация гема, ответ развернутого белка (UPR) и, в случае GCN2 , аминокислотная депривация ⁴² (дополнительный рис.6в). Активация пути ISR, в свою очередь, способствует адаптации клеток к преодолению этих стрессовых условий. Таким образом, активация пути ISR-GCN2 может представлять собой путь стрессовой реакции и защитный механизм, используемый подмножеством злокачественных клеток в MM. Примечательно, что аналогичный набор терминов, относящихся к ISR-GCN2, также был обнаружен с использованием неотрицательной матричной факторизации (дополнительный рис. 6d), как и отдельный набор терминов, связанных с пролиферативными процессами, подобными программе подобия B, описанной выше (дополнительный рис.6e), что дополнительно подтверждает существование этих субклональных злокачественных программ в опухолях Vκ * MYC.

Чтобы понять, как путь ISR-GCN2 связан с прогрессированием заболевания, мы количественно оценили активацию этого пути в злокачественных клетках всех мышей Vκ * MYC, используя набор генов «Ответ EIF2AK4 на аминокислотный дефицит» (подпись ISR-GCN2 , n = 87 генов, дополнительный рисунок 6f, дополнительные данные 11). Мало того, что путь ISR-GCN2 был активирован в злокачественных клетках из всех групп заболеваний по сравнению с нормальными плазматическими клетками, но самый высокий уровень активации ISR-GCN2 также наблюдался в злокачественных клетках мышей с самыми ранними стадиями заболевания (ранняя MM). (Инжир.4в). Примечательно, что активация ISR-GCN2 не была положительно связана с путем UPR и не коррелировала положительно с другими ветвями пути ISR, такими как PERK (рис. 4c и дополнительный рис. 6g). Однако активность ISR-GCN2 сильно коррелировала с трансляцией белка ( R = 0,847, P = 2,2e-16, рис. 4c, дополнительный рис. 6g), подтверждая, что активация ISR-GCN2 и трансляция белка связаны . Учитывая роль MYC в стимулировании синтеза белка, эти результаты выдвинули модель заболевания у мышей Vκ * MYC, в соответствии с которой активация ISR-GCN2 происходит на ранней стадии патогенеза заболевания, чтобы выдержать клеточный стресс, вызванный активацией MYC и, как следствие, избыточной трансляцией белка (дополнительный рис. .6в). Однако, поскольку MYC остается активированным на протяжении всей прогрессии Vκ * MYC, последующее снижение активности ISR-GCN2 у мышей int-MM (рис. 4c) и субклональный характер активации ISR-GCN2 у мышей с активным MM (рис. 4a) предполагает что активация GCN2 может регулироваться другими механизмами, которые управляют дефицитом аминокислот. Мы предполагаем, что при миеломе это может быть вызвано избыточной выработкой белков иммуноглобулинов, что является характерным физиологическим процессом при миеломе.

Наблюдение, что активация ISR-GCN2 субклональна у мышей с активной ММ, но имеет наибольшую активность у мышей с ранней ММ, предполагает, что молекулярная изменчивость при запущенном заболевании может отражать остаточные программы от предшествующего заболевания.Чтобы поддержать эту модель прогрессии, мы оценили кластеры транскрипции у мышей с активной MM, используя высоко экспрессируемые гены у мышей int-MM, полученные из нашего продольного анализа («Peak-Intermediate», Fig. 2e). При этом мы обнаружили, что гены «промежуточного пика» были высоко экспрессированы только в подмножестве клеток мышей с активным MM (дополнительный рис. 6h) и что пути, связанные с этими кластерами, также были связаны с иммунными процессами (дополнительный рис. 5, Программа C). Таким образом, эти данные предполагают, что программы экспрессии генов, которые когда-то определяли ландшафт злокачественных клеток на стадиях-предшественниках, становятся субклональными на поздних стадиях болезни по мере того, как опухоли диверсифицируются (рис.5).

Графика частично создана с использованием BioRender.com.

Ингибирование GCN2 представляет собой терапевтическую стратегию против ММ

Поскольку субклоны, управляемые ISR-GCN2, были обнаружены у всех мышей с активным ММ, мы затем оценили, имеет ли этот путь значение для лечения миеломной болезни человека. Для этого мы оценили общедоступные данные экспрессии в образцах первичных плазматических клеток костного мозга, используя сигнатуру гена ISR-GCN2.Это включало данные массовой экспрессии от Chng et al. ⁴³ (134 образца: 15 здоровых доноров, 22 MGUS, 24 SMM, 73 вновь диагностированных MM) и набор данных scRNA-seq от Ledergor et al. ¹² (35 образцов: 11 здоровых доноров, 6 MGUS, 6 SMM и 12 MM). В обоих наборах данных значительное прогрессивное увеличение баллов ISR-GCN2 было обнаружено на разных стадиях заболевания от MGUS до MM (рис. 6a, b), предполагая, что активация этой транскрипционной программы связана с прогрессированием от болезни-предшественника к явной MM.Рассматривая каждого пациента индивидуально, наш анализ также подтверждает, что путь ISR-GCN2 более активен в подгруппе пациентов с ММ (дополнительный рис. 7a, b). Подобно мышам Vκ * MYC, активация ISR-GCN2 была сильно связана с трансляцией белка как Chng et al. и Ledergor et al. наборы данных (дополнительный рисунок 7c, d), но не с UPR или связанными с PERK ISR (дополнительный рисунок 7c, d). Взятые вместе, эти результаты подтверждают, что путь ISR-GCN2 очень активен в подгруппе пациентов с миеломой, коррелирует с повышенными уровнями трансляции белка и связан с прогрессированием заболевания.Таким образом, мы затем оценили, необходим ли этот путь для выживания миеломных клеток.

a Оценка сигнатуры гена ISR-GCN2 в общедоступных микрочиповых данных пациентов от Chng et al. ⁴³ рассчитано как среднее из масштабированных значений экспрессии для генов из набора генов ISR-GCN2. b Оценка сигнатуры гена ISR-GCN2, рассчитанная с использованием программы Seurat’s AddModuleScore в общедоступных данных scRNA-seq пациентов от Ledergor et al. ¹² по группам болезней. Статистические сравнения нескольких групп (здоровых по сравнению с каждой группой болезней) в ( a ) и ( b ) были выполнены с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона (двусторонний) с поправкой на множественное тестирование (Benjamini-Hochberg). Коробчатые диаграммы в ( a ) и ( b ) представляют распределение каждого измерения в определенных группах, где центральный прямоугольник охватывает межквартильный диапазон, центральная линия представляет собой медианное значение, а «усы» над и под прямоугольником показывают значение 1.5-кратный межквартильный размах. c МТТ-анализ обработки GCN2iB в HMCL (1 мкМ, 72 ч). Данные представляют собой среднее значение биологических повторов ( n = 2 для MY5, JJN3, XG6, AMO1 и RPMI8226; n = 3 для XG7, OPM2; n = 4 для MM1S, U266) с полосами ошибок, представляющими стандартные отклонение показано для образцов с более чем двумя биологическими повторами. d Корреляция Пирсона (корреляционный тест, двусторонний) между оценкой сигнатуры гена ISR-GCN2 ( x -ось) и жизнеспособностью относительно ДМСО (1 мкМ GCN2iB, y -ось).Линия линейной регрессии отображается черным цветом, а доверительный интервал заштрихован серым цветом. Каждая точка представляет собой один HMCL. e Проточно-цитометрический анализ апоптоза в клетках U226 после 48-часовой обработки 5 мкМ GCN2iB. f Проточно-цитометрический анализ апоптоза в опухолевых клетках Vκ12598 (CD138 ⁺ / B220 ^— ) после 48-часовой обработки 5 мкМ GCN2iB. Диаграммы разброса в ( e ) и ( f ) представляют несколько независимых экспериментов (см. Дополнительный рис.8в, г). Квадранты, соответствующие жизнеспособным опухолевым клеткам, выделены красным. г Столбчатые диаграммы, изображающие выживаемость клеток, определенную с помощью анализа трипанового синего, в HMCL с нокаутом GCN2. Высота столбцов представляет собой среднюю относительную жизнеспособность из двух независимых экспериментов (как показано отдельными точками данных). Исходные данные представлены в SourceData_Fig. 6.xlsx.

GCN2 недавно стал многообещающей мишенью для лечения солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований ^{43,44,45,46,47} , но неизвестно, представляет ли этот путь терапевтическую уязвимость при ММ.Поэтому мы обработали панель линий клеток миеломы человека (HMCL, n = 9) низкомолекулярным ингибитором GCN2, GCN2iB ⁴⁴ , чтобы оценить, зависят ли клетки миеломы от пути ISR-GCN2 для выживания. Этот анализ показал, что лечение GCN2iB обладает противомиеломной активностью, но вызывает ряд ответов в HMCL (рис. 6c), которые, как мы предположили, могут коррелировать с различиями в активации базального пути ISR-GCN2. Действительно, оценивая общедоступные данные экспрессии HMCL с использованием сигнатуры ISR-GCN2, мы обнаружили статистически значимую обратную связь между оценкой ISR-GCN2 и жизнеспособностью после лечения GCN2iB ( R = -0.605, P = 0,028, фиг. 6d), подтверждая, что линии клеток с более высокой активностью ISR-GCN2 более чувствительны к GCN2iB. Примечательно, что показатели подписи MYC, определенные для каждого HMCL, не коррелировали с ответом GCN2iB ( R = -0,067, P = 0,829, дополнительный рис. 8a) или активностью ISR-GCN2 ( R = 0,077, P = 0.802, дополнительный рис. 8b), предполагая, что активация ISR-GCN2 не может быть однозначно связана с дисрегуляцией MYC при миеломе человека. Тем не менее, для дальнейшего подтверждения роли пути ISR-GCN2 в выживаемости миеломы, GCN2iB-чувствительные HMCL, а также опухоли Vκ * MYC (Vκ12598) подвергаются апоптозу при лечении GCN2iB (рис.6e, f и дополнительный рис. 8c, d). В соответствии с этими эффектами генетический нокаут GCN2 в GCN2iB-чувствительных HMCL, RPMI-8226 и OPM2, снижал жизнеспособность клеток (рис. 6g и дополнительный рис. 8e), но не влиял на жизнеспособность GCN2iB-нечувствительных HMCL, MM1S, и XG7 (дополнительный рис. 8e, f). Таким образом, наши данные подтверждают, что клеточные ответы на стресс через путь ISR-GCN2 активны в субпопуляции HMCL и, в свою очередь, могут представлять собой важный процесс, управляющий прогрессированием новообразований плазматических клеток.Эти данные не только обеспечивают мишень против миеломы, но и сопутствующий биомаркер, который может определять индивидуальную терапевтическую полезность.

Армия 21, ВВС 14, ОТ

ARMY_Tyler 9 пробег (удар Тэлли), 11:06.

AFA_FG Dapore 39, 6:07.

АРМИ_Т.Робинсон 79 пас Андерсон (удар Тэлли), 5:07.

AFA_Kinamon 4 пас Дэниелс (Хьюз ран), 10:23.

AFA_FG Dapore 30,: 23.

ARMY_Law 0 пробег (удар Тэлли),: 00.

___

___

RUSHING_Army, Тайлер 15-39, Адкинс 7-21, Робинсон 4-18, Бьюкенен 4-12, Ховард 1-10, Уолтерс 2-4, Андерсон 9-3, Мерфи 1- (минус 5).Air Force, Робертс 18-68, Дэниелс 15-54, Фаттах 12-41, Хьюз 1-10, Кинамон 1-3, Льюис 1-0, (Команда) 2- (минус 1).

PASSING_Army, Андерсон 7-12-0-175, Тайлер 1-1-0-39. Эйр Форс, Дэниелс 13-22-0-226, Кинамон 0-1-1-0.

RECEIVING_Army, Alston 4-79, Robinson 2-118, Walters 1-10, Caterbone 1-7.